楊大偉,臧歡歡,楊慧敏,孫 旭,李 瑩,袁伶俐

(1.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科,安徽 蚌埠 233004;3.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨科,安徽 蚌埠 233000)

強直性脊柱炎(AS)是一種慢性自身炎癥性疾病,以中軸關節(jié)受累為主,主要累及骶髂關節(jié)、脊柱骨樣突、脊柱旁軟組織等,也可伴有關節(jié)外表現(xiàn)(如葡萄膜炎或虹膜炎),嚴重時可發(fā)生脊柱畸形和關節(jié)強直[1-2],對患者生活質量造成很大影響。但AS的病因和發(fā)病機制目前仍不十分明確。有研究表明,γ-干擾素(IFN-γ)與多種自身炎癥和免疫疾病相關,如免疫球蛋白A腎病、多發(fā)性硬化癥等[3-4]。也有研究表明,在中國漢族人群中IFN-γrs2069727基因多態(tài)性與AS起病顯著相關[5]。袁躍興等[6]發(fā)現(xiàn),AS患者血清IFN-γ表達水平顯著升高,且與C 反應蛋白(CRP)呈正相關。提示IFN-γ可能作為致炎因子參與了AS的起病及病情活動。而IFN-γ為細胞Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)非依賴信號通路重要的末端炎癥因子[7],提示TLR4/MyD88非依賴信號通路也可能參與了AS的發(fā)生。本研究通過檢測AS患者血清及滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路中重要上游節(jié)點分子——TLR4、Toll樣受體相關分子(TRAM)、TIR域含適配器誘導β-干擾素(TRIF)、核因子-κB(NF-κB)及末端炎癥因子——IFN-γ的表達,探討了TLR4/MyD88非依賴信號通路在AS起病及病情活動中所起的作用,旨在為治療AS提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 (1)試驗1:選取2019年1月至2021年12月在蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科就診的AS患者46 例作為AS組,其中男31 例,女15例;年齡15～61歲,平均(37.50±11.19)歲;平均身高(169.76±5.59)cm;平均體重指數(shù)(23.06±2.35)kg/m2。選取同期健康體檢者30例為健康對照組,其中男25例,女5例;年齡27～57 歲,平均(38.90±7.70)歲;平均身高(171.43±5.37)cm;平均體重指數(shù)(23.85±1.57)kg/m2。2組研究對象性別、年齡、身高、體重指數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2)試驗2:選取13例行髖關節(jié)置換術AS患者滑膜組織作為AS手術組,其中男9例,女4例;年齡36～56歲,平均(47.53±7.16)歲;平均身高(169.15±5.79)cm,平均體重指數(shù)(23.85±1.83)kg/m2。選取10例同期髖關節(jié)創(chuàng)傷性骨折患者滑膜組織作為對照組,其中男7例,女3例;年齡28～56歲,平均(42.0±8.79);平均身高(168.8±4.59)cm;平均體重指數(shù)(24.22±1.85)kg/m2。2組患者性別、年齡、身高、體重指數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AS手術組及對照組滑膜組織均為患者手術時取得。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批(倫理編號:蚌埠醫(yī)學院倫科批字[2021]第247號)。樣本收集均取得研究對象知情同意,均簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清紅細胞沉降率(ESR)、CRP、 IFN-γ檢測 ESR、CRP均于蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科完成檢測。IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司(貨號:ZK-H1171),嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.2AS病情活動度評分(ASDAS)-CRP 采取ASDAS-CRP評價AS疾病活動度。ASDAS-CRP=0.12×腰背痛+0.06×晨僵持續(xù)時間+0.1×患者總體評價+0.07×外周關節(jié)疼痛/腫脹+0.58×Ln(CRP+1)。腰背痛、晨僵持續(xù)時間、患者總體評價、外周關節(jié)疼痛/腫脹均采用疼痛視覺模擬疼痛量表進行評價,0分為不存在不適感,10分為嚴重不適。ASDAS作為新型AS疾病活動度指標由國際脊柱關節(jié)炎評價工作組于2009年首先提出[8]。

1.2.3TLR4 /MyD88非依賴信號通路相關分子mRNA表達水平測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法測定TLR4/MyD88非依賴信號通路相關分子mRNA表達水平。嚴格按RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,用TP800 PCR擴增儀按實時熒光定量PCR說明書采用探針法對cDNA進行PCR檢測、擴增,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,以95 ℃預變性30 s,然后進行循環(huán)擴增,95 ℃變性5 s,60 ℃退火加延伸30 s,共40個循環(huán),反應結束后進行溶解曲線分析。RNA抽提試劑盒(Code No.9767)、反轉錄試劑盒(Code No.RR036A)、實時熒光定量PCR檢測試劑盒(Code No.RR391A)、熒光定量PCR擴增儀(TP800)均購自日本TaKaRa公司,TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ、內(nèi)參GAPDH引物均由上海生物工程技術服務有限公司設計合成。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達水平。各信號分子引物見表1。

表1 各信號分子引物

2 結 果

2.12組研究對象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比較 AS組患者血清ESR、CRP、IFN-γ水平均明顯高于健康對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組研究對象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比較

2.2AS患者血清IFN-γ水平與CRP、ESR、ASDAS-CRP 的相關性 AS患者血清IFN-γ水平與ESR、CRP、ASDAS-CRP水平均呈正相關(r=0.762、0.776、0.405,P<0.001、<0.001、0.005)。

2.32組患者滑膜組織TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表達水平比較 與對照組滑膜組織比較,AS手術組患者滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路重要節(jié)點分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA 表達水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

3 討 論

TLR4是膜蛋白家族中的一員,可識別不同病原體的病原相關分子模式(包括格蘭陰性菌脂多糖、熱休克蛋白、磷壁酸等),激活體內(nèi)胞內(nèi)信號通路,并誘發(fā)免疫相關基因和促炎基因的表達,引起炎性反應。根據(jù)是否需要MyD88分子介導分為MyD88依賴和MyD88非依賴兩種信號通路。TLR4經(jīng)MyD88依賴通路誘發(fā)腫瘤壞死因子-α的釋放,引起早期炎性反應,而經(jīng)Myd88非依賴通路則激活晚期NF-κB和干擾素調節(jié)因子3(IRF-3)的轉錄。有研究表明,TRAM特異性介導了TLR4/MyD88非依賴信號通路,是激活TRIF,活化IRF3、NF-κB信號蛋白必不可少的重要銜接分子,而對TLRs中的其他受體無作用[9]。NF-κB是調控細胞增殖、凋亡、惡性轉化及浸潤的重要的核轉錄因子,當細胞受到炎性細胞因子刺激后激活κB抑制因子激酶(IKK)復合體等特定的蛋白激酶,κB抑制因子磷酸化、泛素化后立即被蛋白酶體降解,導致NF-κB釋放,核易位進入細胞核,啟動相關基因的轉錄[10]。在TLR4/MyD88非依賴信號通路中TLR4通過TRAM激活TRIF,TRIF與接頭蛋白募集腫瘤壞死因子受體相關因子6綁定,使下游TRNK結合激酶1分子磷酸化,TRNK結合激酶1緊接著激活絲裂原激活的蛋白激酶和NF-κB,而NF-κB 可激活IRF3[7,9,11],釋放大量IFN-γ,而IFN-γ作為TLR4/MyD88非依賴信號通路重要的末端炎癥因子具有多種生物學作用:(1)可激活巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞等一系列具有免疫活性的細胞,并促進其功能。(2)也可促進包括抗原呈遞細胞在內(nèi)的多種細胞表達主要組織相容性復合體Ⅰ類分子和Ⅱ類分子[12]。(3)促進輔助性T淋巴細胞0分化為輔助性T淋巴細胞1,并抑止輔助性T淋巴細胞2增殖。(4)促進細胞毒性T淋巴細胞成熟及活化。(5)促進B淋巴細胞分化,產(chǎn)生抗體及免疫球蛋白類型轉化;此外,其還可通過上調某些趨化因子和自身受體的表達,降低上皮細胞屏障功能,促進中性粒細胞遷移,引發(fā)炎性反應[13]。

欽丹萍等[14]研究表明,在三硝基苯磺酸/乙醇聯(lián)合灌腸的方法建立三硝基苯磺酸 /乙醇潰瘍性結腸炎大鼠模型的腸黏膜中TLR4 /MyD88非依賴信號通路相關分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB、IFN-γ無論在mRNA 還是蛋白表達水平均明顯高于健康對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示MyD88非依賴信號通路參與了潰瘍性結腸炎大鼠炎癥活動的調控。同時,也有研究表明,IFN-γ在炎癥性腸病患者腸黏膜上的表達也明顯增加[15]。DOLHAIN等[16]發(fā)現(xiàn),類風濕關節(jié)炎(RA)患者血清及滑膜組織IFN-γ水平明顯高于骨性關節(jié)炎患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MANOURY-SCHWARTZ等[17]對RA小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ可損傷關節(jié),引起關節(jié)炎癥,RA小鼠注射IFN-γ單抗后不僅能減輕關節(jié)炎程度,還能降低關節(jié)炎發(fā)生率。付曉敏等[18]應用免疫組織化學方法對AS 患者滑膜組織TLR4及其信號通路中主要分子,如MyD88、NF-κB-p65 進行檢測發(fā)現(xiàn),AS患者滑膜組織TLR4、NF-κB-p65表達陽性,MyD88表達陰性,提示經(jīng)由TLR4/MyD88非依賴信號通路引起免疫炎性反應,從而參與了AS發(fā)病及病情活動。

本研究結果顯示,AS患者血清IFN-γ水平明顯高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且IFN-γ與CRP、ASDAS-CRP均呈正相關,提示IFN-γ可能作為促炎性細胞因子參與了AS發(fā)病及病情活動。本研究進一步對AS患者滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路中的重要上游節(jié)點分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65及末端炎癥因子——IFN-γ檢測結果顯示,與對照組比較,AS手術組患者滑膜組織TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表達水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述,TLR4/MyD88非依賴信號通路可能在AS起病及病情活動中起到重要作用。后期將進一步通過免疫組織化學及Western blot等方法檢測AS患者治療前后TLR4/MyD88非依賴信號通路相關分子表達情況,為TLR4/MyD88非依賴信號通路參與AS起病及病情活動提供更充分的證據(jù),從而為治療AS提供新思路。