孔海全,李明遠(yuǎn),巫相宏△

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣西 南寧 530000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣西 百色 533000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病,炎癥的促進(jìn)和緩解機(jī)制的平衡決定了最終的臨床結(jié)果[1]。縫隙連接蛋白43(Cx43)主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞中,Cx43介導(dǎo)的縫隙連接通訊對(duì)心血管系統(tǒng)的發(fā)育和正常功能具有重要作用[2]。脂多糖發(fā)揮作用的主要活性成分是類(lèi)脂A(KLA),脂多糖可激活并損傷內(nèi)皮細(xì)胞,引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,從而導(dǎo)致AS[3]。已有研究證實(shí)了脂多糖可促進(jìn)大鼠血管組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx43表達(dá)升高[4]。LY294002是一種人工合成的ClassⅠ磷酸肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑,可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗ClassⅠ PI3K中P110催化亞基和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的結(jié)合使PI3K失去活性而阻斷PI3K信號(hào)通路的活化[5]。已有研究表明,LY294002具有抵抗腫瘤細(xì)胞惡性生長(zhǎng)同時(shí)抑制腫瘤血管生成[6]、減少細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生[7]等作用。本研究觀察了PI3K通路特異性抑制劑——LY294002對(duì)KLA刺激的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)Toll樣受體 4(TLR4)、PI3K和Cx43蛋白及mRNA表達(dá)的影響,探討了LY2940002通過(guò)抑制TLR4/PI3K信號(hào)通路對(duì)KLA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷反應(yīng)的影響,旨在為預(yù)防AS提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1材料 HCAEC細(xì)胞株、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)均購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司,LY294002購(gòu)自美國(guó)CST公司,TLR4激動(dòng)劑——KLA購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar Lipids公司,CCK8法試劑盒購(gòu)自中國(guó)美侖公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 原代HCAEC為中國(guó) Procell普諾賽公司產(chǎn)品(貨號(hào)CP H087),通過(guò)廣西卓一代理商購(gòu)買(mǎi)。細(xì)胞培養(yǎng)基成分為100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清和100 U/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境保持在37 ℃、5%二氧化碳條件下,1～3 d換液1次,待細(xì)胞密度至80%以上即可傳代,選取同代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

1.2.2.1檢測(cè)KLA對(duì)HCAEC活力的影響 根據(jù)加入KLA的不同質(zhì)量濃度分為5組,即0、0.01、0.05、0.10、0.20 mg/L組,每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)基和相應(yīng)質(zhì)量濃度的KLA,置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中24 h,然后終止培養(yǎng),每孔加入10 μL CCK8溶液,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀讀取吸光度(A)值。

1.2.2.2檢測(cè)LY294002對(duì)HCAEC活力的影響 采用與1.2.2.1項(xiàng)同樣的方法檢測(cè)0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L LY294002對(duì)HCAEC活力的影響。為防止不同代數(shù)細(xì)胞活力的誤差,使用同一代數(shù)HCAEC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞活力確定后續(xù)KLA和LY294002的最適實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度。

1.2.3分組及干預(yù) 將HCAEC分為以下4組進(jìn)行后續(xù)Western Blot實(shí)驗(yàn),每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上。(1)空白對(duì)照組(Con組)不進(jìn)行其他任何處理,使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基正常培養(yǎng) HCAEC 24 h。(2)TLR4激動(dòng)組(KLA組)使用含 KLA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng) HCAEC 24 h。(3)PI3K抑制組(LY組)使用含LY294002的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)HCAEC 24 h。(4)KLA+LY組先加入LY294002預(yù)處理4 h后加入KLA培養(yǎng)HCAEC 24 h。

1.2.4Western Blot法檢測(cè)HCAEC TLR4、PI3K、Cx43 蛋白表達(dá) 將細(xì)胞裂解液加入細(xì)胞中并在冰上裂解細(xì)胞10 min,離心后收集上清液;采用BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。每孔40 μg蛋白,在聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗孵育過(guò)夜,第2天加入二抗,孵育1 h 后進(jìn)行顯影處理,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參,使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH校正后的灰度值比值作為其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1不同質(zhì)量濃度KLA、LY294002 HCAEC存活率比較 0.01、0.05 mg/L KLA HCAEC存活率[分別為(99.30±2.54)%、(97.06±2.96)%]與0 mg/L[(100.02±1.79)%]比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.524、1.918,P=0.614、0.091);0.10、0.20 mg/L KLA HCAEC存活率[分別為(88.04±3.07)%、(67.98±3.57)%]均明顯低于0 mg/L,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.529、17.950,P均<0.001)。最終選擇 KLA 0.05 mg/L作為對(duì) HCAEC炎性刺激的工作質(zhì)量濃度。2.5 μmol/L LY294002 HCAEC存活率[(100.16±1.73)%]與0 μmol/L[(100.52±2.17)%]比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.284,P=0.784);5.0、10.0、20.0 μmol/L LY294002 HCAEC存活率[分別為(80.85±1.74)%、(70.92±2.09)%、(49.18±1.76)%]均明顯低于0 μmol/L,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.820、21.989、41.112,P均<0.001)。最終選擇2.5 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理質(zhì)量濃度。不同質(zhì)量濃度KLA、LY294002對(duì)HCAEC活力的影響見(jiàn)圖1。

注:與0 mg/L KLA、0 μmol/L LY294002比較,aP<0.05。

2.2各組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43 蛋白表達(dá)水平比較 KLA組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達(dá)水平均明顯高于Con組,KLA+LY組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達(dá)水平明顯低于KLA組,LY組HCAEC PI3K蛋白表達(dá)水平明顯低于Con組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LY組HCAEC TLR4、Cx43蛋白表達(dá)水平與Con組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1,圖2、3。

注:與Con組比較,aP<0.05 ;與 KLA 組比較,bP<0.05。

圖3 各組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達(dá)水平比較

表1 各組HCAEC TLR4、PI3K、Cx43蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

近年來(lái),AS逐漸被認(rèn)為是脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的、慢性、低級(jí)別的動(dòng)脈壁炎癥性疾病[8],抗炎越來(lái)越被認(rèn)為是進(jìn)一步降低AS性心血管疾病殘余風(fēng)險(xiǎn)的有吸引力的策略。TLR4信號(hào)通路可通過(guò)多途徑參與AS的進(jìn)程,并參與一系列與AS相關(guān)的細(xì)胞因子、炎癥因子的合成與釋放等環(huán)節(jié)[9]。LI等[10]發(fā)現(xiàn),Corilagin可通過(guò)抑制單核/巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路,減少促炎性細(xì)胞因子的釋放,改善AS斑塊的發(fā)展。WAHID等[11]發(fā)現(xiàn),TLR4是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子,可驅(qū)動(dòng)子宮激活和控制分娩時(shí)機(jī),干預(yù)TLR4信號(hào)可能對(duì)有早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)或足月后妊娠的婦女有治療作用。有研究發(fā)現(xiàn),TLR4激動(dòng)劑可通過(guò)Cx43半通道在巨噬細(xì)胞中觸發(fā)ATP的釋放,從而影響膿毒癥患者的預(yù)后[12]。另外有研究表明,TLR4通路激活后Cx43表達(dá)明顯增加,且呈劑量和時(shí)間依賴性[13]。本研究結(jié)果顯示,使用KLA刺激HCAEC后可激活其TLR4信號(hào)通路;而且KLA至少部分通過(guò)激活TLR4相關(guān)的PI3K通路上調(diào)Cx43的表達(dá),與既往研究結(jié)果相似。

PI3K信號(hào)通路的激活可使細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子,在機(jī)體炎性反應(yīng)和AS的發(fā)展與消退中發(fā)揮著重要作用[14]。有研究表明,抑制PI3K、蛋白激酶B (Akt)、腫瘤壞死因子-α mRNA表達(dá)對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE基因敲除小鼠具有抗AS的作用[15]。EISENREICH等[16]發(fā)現(xiàn),使用PI3K抑制劑抑制PI3K信號(hào)通路的傳導(dǎo)可抑制AS的形成,減少斑塊面積[17]。既往研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路參與了高果糖飼料誘導(dǎo)AS的發(fā)生、發(fā)展[18]。表明似乎抑制PI3K信號(hào)通路對(duì)抑制AS具有積極的作用。本研究結(jié)果顯示,PI3K抑制劑——LY294002能明顯抑制KLA誘導(dǎo)的TLR4、PI3K、Cx43的表達(dá),但并不影響正常狀態(tài)下HCAEC TLR4、Cx43的表達(dá),這一發(fā)現(xiàn)可能為將來(lái)LY294002的使用范圍提供方向。

Cx43的表達(dá)調(diào)控了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成,抑制Cx43可降低細(xì)胞增殖和血管生成[19]。有研究發(fā)現(xiàn),AS的冠心病患者Cx43、Cx46的表達(dá)均顯著上調(diào)[20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),小鼠Cx43的普遍減少對(duì)AS病變的進(jìn)展和組成具有有益作用[21]。有研究表明,銀杏通過(guò)抑制Cx43的表達(dá)抑制AS進(jìn)展[22]。有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α通過(guò)下調(diào)Cx43誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)AS斑塊的穩(wěn)定。既往研究表明,降低Cx43可通過(guò)減少炎性反應(yīng)和減少平滑肌細(xì)胞遷移和增殖限制急性血管損傷后新內(nèi)膜的形成[23],血管緊張素Ⅱ上調(diào)Cx43促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[24],無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員3A(Wnt3a)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的收縮和分泌表型與Cx43的表達(dá)增加有關(guān)[25]。由此看來(lái),Cx43在平滑肌細(xì)胞中似乎發(fā)揮著重要的作用。在AS易感的低密度脂蛋白受體缺陷小鼠中Cx43表達(dá)的整體降低可減慢AS斑塊形成的進(jìn)程[25]。既往研究表明,下調(diào)Cx43表達(dá)可顯著降低單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附[26],而單核細(xì)胞-內(nèi)皮黏附是AS發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。另一方面值得注意的是,表達(dá)Cx43的不同細(xì)胞類(lèi)型(平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)在AS發(fā)生中的確切作用仍有待于證實(shí),但似乎減少血管Cx43表達(dá)的策略可能對(duì)AS具有保護(hù)作用[27]。提示下調(diào)Cx43似乎是抑制AS的重要途徑之一。本研究結(jié)果顯示,LY294002可抑制由KLA誘導(dǎo)的HCAEC Cx43高表達(dá),表明LY294002在治療AS方面也許具有不小的潛力。

總之,使用LY294002可抑制由KLA誘導(dǎo)的HCAEC Cx43高表達(dá),其機(jī)制至少部分與抑制TLR4/PI3K信號(hào)通路有關(guān),為此 LY294002很可能成為治療AS的一個(gè)重要藥物,可能為治療AS提供新的方案和策略。