宋霞,劉亞蓉,李永鵬,卜晨琛,喬亞玲,王珺,張春平,吳立斌,海平

(青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥藏藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016)

索羅瑪布,漢語(yǔ)翻譯為紅景天,始載于《四部醫(yī)典》,根據(jù)各地藏醫(yī)用藥索羅瑪布均為景天科植物,共計(jì)3屬10種,西藏各地藏醫(yī)院以大花紅景天為常用藥材[1-2]?！毒е楸静荨酚涊d:“嘎都爾清熱,治肺炎;可分為二品,上品根粗硬如圓穗蓼干燥根,下品外形和皮都像蘇羅瑪保(紅景天),但味澀,各地藏醫(yī)用景天科狹葉紅景天等,外形和皮均像蘇羅瑪保,可視為正品”[2]。目前我國(guó)具有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)藥用紅景天共5種,紅景天(大花紅景天)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部[3],來(lái)源為景天科植物大花紅景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba的干燥根和根莖。狹葉紅景天(藏文名叫“力嘎都”或“尕都爾”)為藏族常用藥,青海、甘肅、四川藏區(qū)等地區(qū)使用較多,現(xiàn)收載于《青海省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》2020年版[4]、《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》2014年版[5]和《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2020年版[6]。唐古紅景天主要分布在青海、甘肅、四川西部等地,《中國(guó)植物志》已將其名稱修訂為“唐古紅景天”,學(xué)名Rhodiolatangutica(Maxim.)S.H.Fu,唐古特紅景天作為紅景天的一個(gè)來(lái)源收載于《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》(西藏、青海、四川、甘肅、云南、新疆衛(wèi)生局合編)[7]和《青海省藏藥炮制規(guī)范》[8]。高山紅景天產(chǎn)吉林撫松、安圖等長(zhǎng)白山地區(qū)及黑龍江尚志、寧安、海林等縣,現(xiàn)收載于《吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[9]和《浙江省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[10]。長(zhǎng)鞭紅景天收載于《中草藥與民族藥藥材圖譜》[11]和《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》2020年版[12],經(jīng)調(diào)研市場(chǎng)上俗稱小花紅景天,形態(tài)與大花紅景天極其相似,常作為大花紅景天的主要混淆品。全國(guó)第四次中藥資源普查工作中,從青海省18個(gè)縣普查到紅景天屬植物,并確定大花紅景天、狹葉紅景天和唐古紅景天為青海當(dāng)?shù)夭蒯t(yī)藥用紅景天的主要基原[13-14]。目前已有紅景天指紋圖譜或模式識(shí)別相關(guān)報(bào)道[15]。由于大花紅景天、狹葉紅景天、唐古紅景天、長(zhǎng)鞭紅景天和高山紅景天性狀相似,藥材市場(chǎng)和企業(yè)投料時(shí)常存在易混或人為摻雜現(xiàn)象,筆者在本研究采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)建立GC-MS/MS指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別方法,以期為5種藥用紅景天的差異性研究提供參考。

1 材料

1.1儀器 GC-MS TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(三重四級(jí)桿檢測(cè)器,日本島津公司);NIST17質(zhì)譜庫(kù);HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);XPR225型天平(梅特勒儀器上海有限公司,感量:0.01 mg);BSA224S-CW型天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司,感量:0.1 mg);ChemPattern2017先進(jìn)化學(xué)計(jì)量學(xué)系統(tǒng)解決方案軟件(科邁恩北京科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào):110831-201906)、酪醇對(duì)照品(批號(hào):111676-200602)、紅景天苷對(duì)照品(批號(hào):110818-202009)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;大花紅天素(批號(hào):PS011097,CAS號(hào):63026-02-8)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;水為超純水;甲醇為色譜純。不同品種紅景天經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院劉亞蓉主任藥師鑒定,樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 紅景天樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

2.1.1氣相色譜條件 采用5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷為固定液的GC-MS/MS毛細(xì)管柱(0.25 mm ×30 m,0.25 μm);起始溫度為50 ℃,維持2 min,以20 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃,維持10 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣,分流比為50。

2.1.2質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊離子源(EI 源),溫度230 ℃;接口溫度280 ℃;檢測(cè)器電壓相對(duì)于調(diào)諧結(jié)果0.7 kV;溶劑延遲時(shí)間3.5 min;掃描范圍m/z50～500;載氣為氦氣,碰撞氣為氬氣;質(zhì)譜掃描模式為MRM模式。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別取沒(méi)食子酸對(duì)照品、酪醇對(duì)照品、紅景天苷對(duì)照品和大花紅天素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每毫升各含0.2 mg的對(duì)照品溶液,即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品粉末[過(guò)孔徑(355±13) μm(三號(hào))篩]約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.3藥材化合物GC-MS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 查閱狹葉紅景天、大花紅景天、唐古紅景天、高山紅景天、長(zhǎng)鞭紅景天的相關(guān)文獻(xiàn)[16-24],整理并建立各藥材的GC-MS/MS化合物數(shù)據(jù)庫(kù),包括化合物名稱、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量及化合物結(jié)構(gòu)等信息,建立的數(shù)據(jù)庫(kù)為鑒別各品種紅景天提供依據(jù)。自建的數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集大花紅景天30個(gè)成分(其中確認(rèn)沒(méi)食子酸、酪醇、大花紅天素、紅景天苷4個(gè)成分),狹葉紅景天34個(gè)成分(其中確認(rèn)沒(méi)食子酸、酪醇、紅景天苷3個(gè)成分),唐古紅景天26個(gè)成分(其中確認(rèn)沒(méi)食子酸、酪醇、紅景天苷3個(gè)成分),高山紅景天41個(gè)成分(其中確認(rèn)沒(méi)食子酸、酪醇、紅景天苷3個(gè)成分),長(zhǎng)鞭紅景天27個(gè)成分(其中確認(rèn)沒(méi)食子酸、酪醇、紅景天苷3個(gè)成分)。紅景天苷、沒(méi)食子酸、酪醇、大花紅天素4個(gè)成分的GC-MS/MS質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

A.紅景天苷;B.沒(méi)食子酸;C.酪醇;D.大花紅天素。

2.4GC-MS/MS指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以沒(méi)食子酸色譜峰為參照峰(S),結(jié)果表明,在上述條件下混合對(duì)照品溶液保留時(shí)間的RSD均<0.3%,峰面積的RSD均<1.5%,表明該儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取大花紅景天樣品(樣品編號(hào):DH-1)6份,按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,以沒(méi)食子酸色譜峰為參照峰(S),計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.5%,峰面積的RSD均<2%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取大花紅景天(樣品編號(hào)DH-1)供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,分別在 0,4,8,12,24,48 h 進(jìn)樣,以沒(méi)食子酸色譜峰為參照峰(S),計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.3%,峰面積的RSD均<1.5%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5GC-MS/MS指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

2.5.1GC-MS/MS指紋圖譜建立 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備 5種藥用紅景天的供試品溶液,按 “2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。采用ChemPattern2017先進(jìn)化學(xué)計(jì)量學(xué)系統(tǒng)解決方案軟件對(duì)色譜圖進(jìn)行分析,分別建立5種藥用紅景天的共有模式圖,見(jiàn)圖2。大花紅景天共有模式中6號(hào)峰為沒(méi)食子酸,7號(hào)峰為酪醇,17號(hào)峰為大花紅天素(大花紅景天獨(dú)有特征峰),25號(hào)峰為紅景天苷。狹葉紅景天共有模式中9號(hào)峰為沒(méi)食子酸,11號(hào)峰為酪醇,31號(hào)峰為紅景天苷。唐古紅景天共有模式中3號(hào)峰為沒(méi)食子酸,4號(hào)峰為酪醇,16號(hào)峰為紅景天苷。長(zhǎng)鞭紅景天共有模式中9號(hào)峰為沒(méi)食子酸,10號(hào)峰為酪醇。高山紅景天共有模式中4號(hào)峰為沒(méi)食子酸,5號(hào)峰為酪醇,21號(hào)峰為紅景天苷。通過(guò)建立5種藥用紅景天的GC-MS/MS指紋圖譜,并建立各品種化合物數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)各品種的辨認(rèn)提供鑒別依據(jù)。

A.大花紅景天;B.狹葉紅景天;C.唐古紅景天;D.長(zhǎng)鞭紅景天;E.高山紅景天。

2.5.2相似度評(píng)價(jià) 對(duì)分別建立的5種藥用紅景天進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),各品種相似度見(jiàn)圖3。結(jié)果大花紅景天的相似度>0.80,狹葉紅景天>0.45,唐古紅景天>0.95,長(zhǎng)鞭紅景天>0.70,高山紅景天>0.70。結(jié)果表明,狹葉紅景天不同批次指紋圖譜相似度差異較大,可能與其生長(zhǎng)年份有關(guān)。

A.大花紅景天;B.狹葉紅景天;C.唐古紅景天;D.長(zhǎng)鞭紅景天;E.高山紅景天。

2.6GC-MS/MS定量測(cè)定方法學(xué)考察

2.6.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取4種對(duì)照品溶液(沒(méi)食子酸0.46 mg·mL-1,酪醇0.22 mg·mL-1、大花紅天素0.71 mg·mL-1、紅景天苷0.44 mg·mL-1)0.5,1,3,6,8,10 mL,分別置于10 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,即得各系列濃度的單標(biāo)溶液。分別精密吸取各系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μL,注入氣質(zhì)聯(lián)用儀,以各對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,各對(duì)照品回歸方程和線性范圍見(jiàn)表2。

表2 4種化學(xué)成分的回歸方程和線性范圍

2.6.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸、酪醇、大花紅天素、紅景天苷峰面積的RSD分別為0.4%,0.2%,0.3%,0.6%,表明儀器精密度良好。

2.6.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取大花紅景天樣品(樣品編號(hào):DH-1)6份,按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果各份供試品溶液的沒(méi)食子酸、酪醇、大花紅天素、紅景天苷的測(cè)定結(jié)果RSD分別為1.2%,0.8%,1.0%,1.1%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取大花紅景天(樣品編號(hào):DH-1)供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,分別在 0,4,8,12,24,48 h 進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸、酪醇、大花紅天素、紅景天苷的峰面積的RSD分別為0.3%,0.5%,0.9%,0.7%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的大花紅景天(樣品編號(hào):DH-1)粉末(過(guò)三號(hào)篩)6份,每份各約0.25 g,精密稱定,分別置25 mL具塞錐形瓶中,分別精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(1.25 mg·mL-1)3.0 mL、酪醇對(duì)照品溶液(0.95 mg·mL-1)2.0 mL、大花紅天素對(duì)照品溶液(1.12 mg·mL-1)2 mL、紅景天苷對(duì)照品溶液(1.34 mg·mL-1)1.0 mL,精密加入甲醇17 mL,密塞,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄峰面積并計(jì)算回收率,見(jiàn)表3,結(jié)果表明該方法加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

表3 沒(méi)食子酸、酪醇、大花紅天素和紅景天苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7GC-MS/MS定量測(cè)定結(jié)果 每個(gè)樣品取2份,分別按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,記錄峰面積并計(jì)算含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5種樣品測(cè)定結(jié)果

2.8分類模式識(shí)別分析 將5種藥用紅景天和2批未知紅景天的GC-MS/MS圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)ChemPattern2017軟件處理后進(jìn)行分類模式識(shí)別分析,算法為K最近鄰法(KNN),數(shù)據(jù)預(yù)處理方法為Pareto標(biāo)度化,留一交叉驗(yàn)證,K數(shù)值為3,樣本距離為歐式距離。分類模式識(shí)別圖見(jiàn)圖4。5種藥用紅景天作為訓(xùn)練集,2批未知紅景天作為測(cè)試集。5種藥用紅景天分別聚集成一類,2批未知紅景天為新疆購(gòu)買(mǎi)的所謂薔薇紅景天,為切成較碎的飲片,難以從藥材性狀進(jìn)行識(shí)別辨認(rèn),經(jīng)測(cè)試1批為長(zhǎng)鞭紅景天,1批為狹葉紅景天。處理后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,采用正交偏最小二乘判別天。結(jié)果表明分類模式識(shí)別分析法對(duì)于未知樣品的辨認(rèn)具有一定的參考價(jià)值。

圖4 分類模式識(shí)別分析圖

2.9正交偏最小二乘分析(OPLS) 將5種藥用紅景天的GC-MS/MS圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)ChemPattern2017版軟件處理后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,采用正交偏最小二乘判別法,樣本距離為馬式距離,設(shè)定VIP值為0.9,協(xié)方差閾值為0.1,相關(guān)性閾值為0.5,正交偏最小二乘判別分析差異性變量見(jiàn)表5,得到OPLS-V型圖,得分矩陣圖和OPLS-V型圖見(jiàn)圖5。樣品可明顯分為5組,其中大花紅天素、酪醇和紅景天苷的VIP值>0.9;結(jié)果表明5種藥用紅景天的GC-MS/MS數(shù)據(jù)差異特征明顯。

圖5 得分矩陣圖和OPLS-V型圖

表5 正交偏最小二乘判別分析差異性變量

2.10聚類分析 將5種藥用紅景天的GC-MS/MS圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)ChemPattern2017軟件處理后進(jìn)行聚類分析,數(shù)據(jù)預(yù)處理方法為Pareto標(biāo)度化,距離計(jì)算方法為街區(qū)距離,連接方法為誤差平方和法。見(jiàn)圖6,GC-MS/MS數(shù)據(jù)經(jīng)聚類分析后分為兩大類,大花紅景天單獨(dú)聚為一類,其余4種紅景天聚為一大類。唐古紅景天和長(zhǎng)鞭紅景天可單獨(dú)聚為一小類,部分狹葉紅景天和高山紅景天混聚為一類,表明大花紅景天與其余4種紅景天差異特征明顯,狹葉紅景天和高山紅景天存在一定的相似性。

圖6 5種藥用紅景天的聚類分析圖

3 討論

3.1儀器方法的選擇 本研究采用GC-MS/MS法建立5種藥用紅景天的指紋圖譜,與HPLC和UPLC建立的指紋圖譜比較,GC-MS/MS方法簡(jiǎn)便,分析時(shí)間更短,可重復(fù)性強(qiáng),指紋圖譜中各成分吸收強(qiáng)度高、各峰分離度良好且基線平穩(wěn),各色譜峰可以進(jìn)行質(zhì)譜確認(rèn)。整理并建立5種藥用紅景天的GC-MS/MS化合物數(shù)據(jù)庫(kù),包括化合物名稱、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量及化合物結(jié)構(gòu)等信息,建立的數(shù)據(jù)庫(kù)為鑒別各品種紅景天提供依據(jù)。

3.2供試品溶液制備方法考察 分別考察甲醇、乙醇及不同比例的甲醇-水、乙醇-水為提取溶劑,以各共有指紋峰的數(shù)目、峰高為考察指標(biāo),結(jié)果顯示以甲醇為提取溶劑時(shí),共有指紋峰的數(shù)目最多,且峰高比適宜,因此選擇甲醇為提取溶劑;考察甲醇超聲和加熱回流兩種提取方式對(duì)指紋圖譜的影響,以峰數(shù)及共有指紋峰“峰面積/稱樣量”為考察指標(biāo),結(jié)果顯示加熱回流提取時(shí)共有指紋峰的峰數(shù)最多且峰面積最大,因此選擇加熱回流提取方式;分別考察不同加熱回流時(shí)間(30,45,60,90 min)對(duì)指紋圖譜的影響,以共有指紋峰“峰面積/稱樣量”為考察指標(biāo),結(jié)果顯示加熱回流60和90 min時(shí)共有指紋峰的峰面積最高,因此選擇加熱回流60 min。

3.3建立方法對(duì)5種藥用紅景天及其混淆品的區(qū)分 紅景天的混淆品多為其同屬植物,原植物名稱多為“××紅景天”,在紅景天不同產(chǎn)地,不同品種的紅景天當(dāng)?shù)厝私y(tǒng)一稱為“紅景天”。不同品種紅景天的原植物形態(tài)和藥材及飲片性狀極其相似。隨著人們對(duì)紅景天需求不斷擴(kuò)大,野生資源不斷減少,加上大面積種植尚未成功,在實(shí)際流通和應(yīng)用過(guò)程中常出現(xiàn)以不同品種摻入大花紅景天中混用的情況。因此選擇GC-MS/MS化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)、指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別相結(jié)合的方法對(duì)5種藥用紅景天及其混淆品可進(jìn)行有效的辨識(shí)。

指紋圖譜能比較全面地反映中藥材所含的化學(xué)成分信息,進(jìn)而反映中藥材的整體質(zhì)量以及近緣品種的差異性特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5種藥用紅景天的指紋圖譜具有共有指紋峰,不同品種紅景天存在差異性成分,如大花紅景天中含有大花紅天素,其余4種紅景天均無(wú)該成分,因此大花紅天素可以作為大花紅景天的專屬性成分進(jìn)行識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)引入化學(xué)模式識(shí)別法[25-28],分別通過(guò)分類模式識(shí)別分析、正交偏最小二乘分析和聚類分析將5種藥用紅景天加以區(qū)分,找到顯著差異性標(biāo)志化合物大花紅天素、酪醇和紅景天苷,能夠作為區(qū)分5種紅景天的依據(jù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該方法準(zhǔn)確可靠,專屬性強(qiáng),能夠?yàn)?種藥用紅景天的區(qū)分和質(zhì)量控制提供參考。