劉鳳麗,萬仲賢,羅麗華,胡興榮,吳波

(1.湖北民族大學醫(yī)學部,恩施 445000;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥學部,恩施 445000;3.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院放射科,恩施 445000)

現代醫(yī)學認為,骨折愈合過程包含血腫炎癥機化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑形期[1-2]。具有消腫止痛、活血化瘀、強筋健骨功效的中藥,可縮短骨折愈合的炎癥機化期,促進骨折部位血管再生、骨痂形成,對骨折愈合具有促進作用[3-7]。云南白藥主要組成藥物有三七、重樓、麝香、金鐵鎖、草烏、白芨、冰片、披麻草等[1],具有活血化淤、止血定痛、解毒消腫、補血生新等作用,用于治療跌打損傷、軟組織挫傷、閉合性骨折等。前期臨床研究從器官與組織水平揭示了云南白藥促進骨折愈合的藥理作用,但分子水平上的療效與機制研究有待進一步深入,本課題組擬通過X線檢測骨折進程,以酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清中對骨形成具有促進作用的腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、骨鈣素(osteocalcin,OC)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、 Ⅰ型前膠原N 端肽(procollagen I N-Terminal propeptide,PINP)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶5(acid phosphatase 5,ACP5)等蛋白濃度[8-19],采用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色與免疫組化等方法觀察云南白藥促進骨折愈合藥理作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 普通級新西蘭家兔26只,雄性,體質量2.0～2.3 kg[湖北省逸摯誠生物科技有限公司提供,實驗動物合格證:SCXK(鄂)2016-0020],家兔飼養(yǎng)于三峽大學動物實驗中心,飼養(yǎng)條件:相對濕度(55±5)%、溫度20～25 ℃,自由進食、飲水。飼料由湖北省逸摯誠生物科技有限公司提供。本實驗由三峽大學實驗動物福利與倫理委員會批準(No.L2018172)。

1.2試藥 云南白藥粉(云南白藥集團股份有限公司,規(guī)格:每瓶4 g,批號:ZAA2014);苯巴比妥注射液(天津金耀藥液有限公司,批號:2012231);蜂蜜(福建省神蜂科技公司,批號:2021032501)。ACP5、OC、VEGFA、TNF-α、IL-6、bFGF、PINP、ALP的ELISA檢測試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司);無機磷、鈣測定試劑盒(長春匯力生物技術有限公司);豚鼠抗兔血管內皮生長因子A多克隆抗體(CLOUD-CLONE CORP.,PAA143Rb51)。

1.3儀器 電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司,型號:XPR106DUH/AC,感量:0.002 mg);臺式高速冷凍離心機(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司,型號:D1524R);全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技,型號:chemray160);咬骨鉗( 恩施市興達醫(yī)療器械有限公司,訂制) ;ELx808酶標儀(美國Biotek公司);Logiq E9彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司);DR儀( 荷蘭飛利浦公司,啟明星);石蠟切片機(金華科迪儀器設備有限公司,型號:KD-2258);生物組織攤片機(金華科迪儀器設備有限公司,型號:KD-P);生物組織包埋一體機(金華科迪儀器設備有限公司,型號:KD-BM&BL);HE染色套裝(武漢百杰康生物科技有限公司,型號:RE1100);顯微鏡(OLYMPUS公司,型號:CKX41);成像系統(tǒng)(MshOt MD50);組織切片全景掃描儀(3DHISTECH)。

1.4云南白藥的處理 將云南白藥與煉蜜按1：4比例調配成糊狀,密封保存至少1周,待藥物化學成分充分釋放后使用。

1.5動物造模 將新西蘭家兔按隨機數字法抽選16只,固定后用苯巴比妥鈉經耳緣靜脈麻醉(1.2 mL·kg-1),在家兔左側前肢備皮、消毒。沿橈骨前內側,以橈骨中、下1/3段交界處為中心,依次切開皮膚、淺筋膜、深筋膜,鈍性分離肌肉,暴露橈骨。以咬骨鉗造成橈骨中段5 mm骨缺損,保持尺骨完整。0.9%氯化鈉溶液沖洗。逐層縫合,包扎傷口,無外固定,拍DR片以檢驗造模是否成功。術后3 d肌內注射青霉素40萬U,每天1次。

1.6動物分組與給藥方法 將造模成功的家兔12只隨機分為云南白藥組和模型對照組,另設正常家兔6只為正常對照組。造模成功1 d后,云南白藥組:按5 g·kg-1劑量將云南白藥均勻涂抹在無菌紗布塊上,厚度0.3～0.5 mm,將載藥無菌紗布用夾板外固定在造模部位對側面,每3 d換藥1次;模型對照組與正常對照組:以同樣大小夾板包扎固定,夾板更換時間同云南白藥組。

1.7觀察指標及檢測方法

1.7.1X線檢測骨折愈合進程 造模當天和藥物干預第1,2,3,4周末,通過DR儀X 線觀察骨痂陰影情況,觀察骨折線模糊、消失時間,以及骨髓腔貫通時間。

1.7.2血清鈣磷檢測與ELISA檢測 造模當天及藥物干預第1,2,3,4周末,經靜脈采血2～2.5 mL,4 ℃下1500 r· min-1離心5 min(r=40 cm),取上清液,按試劑盒說明書操作方法測定血清鈣、磷濃度,ELISA法檢測IL-6、TNF-α、OC、VEGFA、PINP、bFGF、ALP、ACP5濃度。

1.7.3骨折愈合及母細胞bFGF表達情況 干預4周后處死兔,以骨折處為中心取橈骨段1 cm,剔除軟組織,取骨折部位標本,將樣本固定、脫鈣、包埋、切片、烤片后備用。將樣本石蠟切片脫蠟至水,依次完成蘇木精染色、伊紅染色、樹膠封片,顯微鏡鏡檢,組織切片全景掃描儀獲取數碼照片;將樣本石蠟切片經二甲苯及乙醇梯度脫蠟至水,分別完成抗原修復、內源性過氧化物酶滅活、特異性位點的封閉、一抗二抗孵育、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色、蘇木精染核、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)返藍、脫水透明、樹膠封片,顯微鏡鏡檢,組織切片全景掃描儀獲取數碼照片,采用Caseviewer軟件任意采集5個視野,Imagej軟件統(tǒng)計5個視野染色陽性面積比。

2 結果

2.1骨折愈合進程 結果見圖1。模型對照組橈骨骨折線造模后第3周變得模糊,第4周消失;骨折愈合處骨組織第4周開始增厚;骨折處骨髓腔第4周未形成。云南白藥組橈骨骨折線造模第2周開始變得模糊,第3周骨折線消失;骨折處骨組織第4周完成增厚,骨髓腔開始形成和貫通。與模型對照組比較,云南白藥組骨折愈合速度與進程均快1周。

圖1 兩組不同時間左前肢橈骨DR檢測結果

2.2血清鈣、磷及鈣磷乘積檢測結果 模型對照組血清鈣造模后逐漸升高,造模后第2周達峰值,第3周開始下降;血清磷造模后第2周逐步升高,造模第4周升至1.822 mmol·L-1;血清鈣磷乘積造模后先升高后降低,造模后第2周達峰值,見表1。云南白藥組血清鈣造模后第1周達到峰值,且較模型對照組高(P<0.05);血清磷造模后一直升高,造模后第2周開始明顯較模型對照組高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型對照組比較,云南白藥組鈣磷乘積自造模后1周開始更高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 3組兔不同時間血清鈣、磷、鈣磷乘積檢測結果

2.3TNF-α與IL-6含量測定結果 見表2。模型對照組造模當天血清TNF-α與IL-6濃度最高,之后呈下降趨勢;云南白藥組血清TNF-α與IL-6濃度呈下降趨勢,與模型對照組比較下降趨勢更顯著。

表2 3組兔不同時間血清TNF-α與IL-6測定結果

2.4ELISA檢測結果 見表3。模型對照組血清OC、VEGFA、PINP、bFGF、ALP濃度造模當天最低,之后呈上升趨勢;云南白藥組血清OC、VEGF、PINP、bFGF、ALP濃度呈上升趨勢,與模型對照組比較上升趨勢更為顯著。模型對照組血清ACP5造模后先呈上升趨勢,造模后第1周達峰值,之后呈較為平緩下降趨勢;云南白藥組血清ACP5呈先升高后降低趨勢,造模后第1周達峰值,與模型對照組比較下降趨勢更明顯。

表3 3組兔不同時間OC,VEGFA,PINP,bFGF,ALP和ACP5檢測結果

2.5骨折部位愈合情況 見圖2。HE染色結果顯示,模型對照組以軟骨細胞正向骨痂轉化并產生數量眾多而孔徑較小的骨髓腔為主,有小部分骨開始鈣化;云南白藥組已經完成軟骨向骨痂轉化,骨髓腔全部形成,部分骨髓腔相互貫通并有序排列,較多骨開始鈣化,產生微小血管。

圖2 2組兔骨折部位HE染色結果

2.6骨折部位骨母細胞bFGF表達情況 見圖3。云南白藥組中,骨母細胞在新產生的骨髓腔內和骨小梁周圍呈有序致密排列,呈長圓卵形。模型對照組5個視野平均染色陽性面積比為0.65%,云南白藥組1.81%,正常對照組0.4%,云南白藥組與模型對照組、正常對照組比較,均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 2組兔骨折部位骨母細胞bFGF表達情況

3 討論

X線檢測結果顯示,與模型對照組比較,云南白藥組新西蘭兔橈骨骨折愈合進程提前1周時間,說明云南白藥對新西蘭兔骨折愈合具有促進作用;骨折部位HE染色結果從骨形成組織與細胞水平說明云南白藥可以提前軟骨向骨痂轉化、骨髓腔形成與貫通、骨鈣化進程和微小血管形成的進程與時間。血清鈣磷及乘積檢測結果說明,云南白藥可以通過提高血清鈣及鈣磷乘積峰值、提前血清鈣峰值來促進骨折愈合。血清中TNF-α和IL-6的ELISA檢測結果說明,云南白藥對炎癥具有良好的抑制作用,這可以抑制骨折早期血腫形成時的過度炎性反應,縮短骨折愈合血腫炎癥機化期。進一步對促進骨形成的ALP、OC、ACP5、VEGFA、bFGF、PINP等蛋白進行檢測發(fā)現,云南白藥可以快速促進ALP、OC、ACP5、VEGFA、bFGF升高,這提示云南白藥具有促進骨形成作用,利于更早形成原始骨痂。通過IHC檢測bFGF來研究云南白藥對骨母細胞的形成與功能的影響,發(fā)現云南白藥具有促進骨母細胞形成作用,進而促進成骨細胞形成與功能活躍。

綜上所述,云南白藥對骨折愈合期的炎性反應具有顯著抑制作用,并可以促進血管生成和骨再生,使骨折愈合進程提前,對骨折愈合有促進作用。骨折愈合是一個十分復雜的過程,其對血管形成和骨折愈合的積極作用是由某種藥材或是多種藥材相互作用的共同結果及其具體關系等問題需要進一步研究和完善。云南白藥有草烏、披麻草等有毒成分,其外用可能存在過敏反應、中毒反應、創(chuàng)面炎癥反應及出血反應等不良反應,本實驗未進行肝功能、腎功能、血小板等血清學的藥物安全性檢測是不足之處。