吳育,汪潔,魏晨旭,張碩,李偉東

(1.南京中醫(yī)藥大學南通附屬醫(yī)院藥劑科,南通 226000;2.南京中醫(yī)藥大學藥學院,南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學泰州分校,泰州 225300)

侵襲轉(zhuǎn)移是肝癌的基本特征,也是影響肝癌治療效果的關(guān)鍵因素。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者存活率非常低,只有9%患者在診斷后存活>5年[1]。蒼耳亭(xanthatin)是20世紀60年代從蒼耳(XanthiumstrumariumL.)中分離得到的一種天然倍半萜內(nèi)酯化合物。研究表明,蒼耳亭對肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌和皮膚癌等具有顯著的抗腫瘤活性[2-4]。蒼耳亭對肝癌裸鼠有明顯的抑制腫瘤作用,并且抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來阻礙腫瘤發(fā)展[5-6]。轉(zhuǎn)錄因子Sal樣蛋白4(Sal-like protein-4 ,SALL4)在調(diào)控miR-146a-5p進而影響HCC外泌體和M2極化中起到至關(guān)重要的作用[7]。肝癌細胞分泌的外泌體miR-103通過靶向多種內(nèi)皮連接蛋白增加血管通透性并促進腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。

外泌體是直徑30～150 nm的囊泡,由內(nèi)吞過程產(chǎn)生,并由多囊體(MVBs)與質(zhì)膜融合分泌。幾乎所有類型的細胞在生理和病理條件下都會釋放外泌體。外泌體是腫瘤細胞與其微環(huán)境相互作用的重要載體,它攜帶多種生物活性物質(zhì),包括mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)等。腫瘤外泌體可以相互作用,被癌細胞本身或存在于腫瘤微環(huán)境或遠離腫瘤部位的其他細胞所吸收,產(chǎn)生不同的作用[9]。MicroRNAs (miRNAs)越來越被認為是代謝、癌癥、程序性細胞死亡或細胞分化等的可行治療靶點。蒼耳亭抗腫瘤是否與腫瘤外泌體有關(guān)筆者尚未見報道,在本研究通過高通量miRNAs測序,篩選蒼耳亭與MHCC97H共培養(yǎng)過程中差異miRNAs,并對其進行驗證,希望為尋找治療肝癌靶點提供有價值的線索。

1 材料與方法

1.1藥物與試藥 蒼耳亭由南京中醫(yī)藥大學李偉東教授實驗室提供,經(jīng)過磁共振及X射線單晶衍射證實是化合物蒼耳亭,其純度達98%。人高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系MHCC97H購于武漢大學。達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM,Sigma-Aldrich,批號:D5796) ;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,BI公司,批號:04-001-1ACS) ;青霉素G 鈉鹽(Sigma-Aldrich 公司,批號:69-57-8) ;硫酸鏈霉素鹽 (AMRESCO 公司,批號:2018382 );二甲亞砜(DMSO,Solarbio公司,批號:D8370)。

1.2儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,型號:3131);超凈工作臺(ESCO Class ⅡBSC,型號:ESCOAC2);倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司,型號:Vert.A1);電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司,型號:BSA224S-CW);測序分析儀 4000(美國Illumina公司)。

1.3外泌體的提取和測定 細胞MHCC97H培養(yǎng)于含5% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素的DMEM中,在相對濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在所有實驗中,蒼耳亭均溶解于DMSO中,終濃度5 μmol·L-1。5 μmol·L-1蒼耳亭處理細胞24 h。實驗分為對照組即未共培養(yǎng)的MHCC97H細胞組(含0.5% DMSO)和蒼耳亭與MHCC97共培養(yǎng)細胞組。采用差速離心(4 ℃下,500×g離心5 min,200×g離心30 min,10 000×g離心60 min)收集上清液。用孔徑0.22 μm無菌過濾器濾過后,加入超高速離心管中,以4 ℃,120 000×g離心70 min,棄去上清液。最后,根據(jù)沉淀量,加入200～400 μL預(yù)冷無菌PBS重懸懸液,為高純度EVs。

1.4外泌體的鑒定

1.4.1透射電鏡鑒定外泌體 用PBS 1 mL清洗EVs 3次。加入2%鋨酸溶液0.5 mL,4 ℃固定2 h后沖洗。分別用50%、70%、80%、90%乙醇1 mL,梯度脫水15 min。然后用100%乙醇1 mL脫水2次,每次20 min。用丙酮1 mL置換2次,每次15 min。然后對其進行浸漬、封裝和聚合。清洗過程依次進行乙酸二氧鈾染色和乙酸鉛染色10 min。最后,使用Malvern NanoSight系統(tǒng)檢測外泌體的顆粒大小。

1.4.2Western blotting鑒定外泌體 細胞用預(yù)冷的PBS洗滌,在RIPA緩沖液中溶解,RIPA緩沖液中添加1 mmol·L-1PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(Bestbio),稀釋1：100。采用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度。等量的蛋白樣品(20 μg)通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。

分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。將膜在TBST的脫脂干奶中封閉2 h,在≤4 ℃抗體孵育過夜:CD9(1：1000)、 HSP70(1：1000)、β-catenin(1：5000)。另一種膜不加抗體TBST溶液孵育作為陰性對照。反復(fù)洗滌后,將膜與二抗結(jié)合。用TBST再次沖洗膜3次,并使用增強的化學發(fā)光襯底。使用圖像分析軟件測量各波段灰度值進行分析。

1.5外泌體的miRNA的分析與驗證 外泌體的miRNA的測序借助研載生物技術(shù)(上海)有限公司平臺完成。用TRIzol試劑提取總RNA,用聚丙烯酰胺凝膠電泳富集18 ～ 30 nt的RNA分子。然后,富集36～44 nt RNAs,用PCR提取試劑盒純化cDNA片段,形成cDNA文庫。結(jié)扎產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選,PCR擴增,文庫借助上海研載生物技術(shù)有限公司的HiSeq 4000 (Illumina)機器進行深度測序。差異miRNAs篩選條件為|log2FoldChange|≥0.58和P<0.05。差異miRNAs的潛在靶基因由miRNA DA預(yù)測,并基于數(shù)據(jù)庫(DAVID)、GO網(wǎng)站 (http://www.geneontology.org/)和KEGG網(wǎng)站(http://www.genome.jp/kegg/)。利用熱圖對歸一化聚類數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換,繪制熱圖。

1.6采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進行差異miRNAs驗證 分別從MHCC97H細胞組和蒼耳亭共培養(yǎng)的MHCC97H細胞組中提取外泌體的總RNA,使用PrimeScript RT試劑盒(TAKARA)進行逆轉(zhuǎn)錄,采用Roche LightCycler 480 II PCR體系與SYBR Green(TAKARA)進行qRT-PCR。U6和ccel-miR-39分別作為miRNAs的內(nèi)參和外參。

2 結(jié)果

2.1外泌體的確證 MHCC97H組和蒼耳亭+MHCC97H組腫瘤外泌體粒徑分別為(145.5±40.8)和(147.2±41.1)nm。透射電鏡觀察顯示外泌體呈杯狀結(jié)構(gòu),直徑在正常范圍內(nèi)。Western blotting實驗顯示CD9和HSP70表達呈陽性,進一步證實純化后的囊泡為外泌體(圖1)。

A.外泌體顆粒尺寸大小;B.透射電鏡觀察外泌體形態(tài);C.免疫印跡法檢測外泌體的陽性生物標志物CD9和HSP70。

2.2外泌體miRNA譜分析 測序結(jié)果顯示,共鑒定出已知miRNAs497個,未被命名的miRNAs 510個?；蚪M比對率75.21%～81.78%,已知miRNA比對率0.59%～0.65%。與對照組比較,蒼耳亭處理的MHCC97H細胞中共鑒定出78個差異miRNAs,其中36個上調(diào)miRNA,42個下調(diào)miRNA(圖2)。熱圖顯示,這些差異miRNAs能夠區(qū)分蒼耳亭共培養(yǎng)的MHCC97H細胞組和MHCC97H細胞組(圖3)。

圖2 蒼耳亭處理MHCC97H細胞后miRNA表達譜火山圖

紅色表示高表達;藍色表示低表達。

2.3外泌體miRNA功能分析 對差異miRNAs的靶基因進行預(yù)測,將其映射到GO數(shù)據(jù)庫中,并進行比較(圖4A)。GO數(shù)據(jù)庫主要從“生物過程”“細胞組成”和“分子功能”三方面進行了分析?！吧镞^程”方面,基因主要與“細胞過程”“代謝過程”和“單一的生物過程”有關(guān)?！凹毎^程”方面,基因主要與“細胞成分”和“細胞器組成”有關(guān)。“分子功能”方面,基因主要與“結(jié)合”和“催化活性”有關(guān)(圖4B)。

圖4 差異miRNA靶基因和所有GO基因的分布情況

2.4KEGG信號通路富集分析 KEGG對差異miRNAs靶基因的功能進行分類,富集出前20條作用的信號通路(圖5A-B)。結(jié)果顯示前20條通路,包括“癌癥通路”“鈣離子信號通路”“PI3K-Akt信號通路”“黏連信號通路”。根據(jù)miRNA測序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)510個未被命名的miRNA,其中對照組發(fā)現(xiàn)287個未命名miRNA,蒼耳亭治療組發(fā)現(xiàn)354個未命名miRNA。KEGG富集分析顯示,差異miRNAs的靶基因主要集中在“鈣離子信號通路”“PI3K-Akt信號通路”“Ras信號通路”“cAMP信號通路”和“癌癥通路”(圖5C)。

A.KEGG分析miRNA靶基因的分布圖;B.KEGG分析差異miRNA靶基因分布圖;C.KEGG富集分析差異miRNA的TOP20信號通路圖;P值越小,顏色越傾向于紅色,點越大,表示通路中的基因越多;D.qRT-PCR驗證差異miRNA表達水平;①與對照組比較,P<0.05;②與對照組比較,P<0.01。

2.5qRT-PCR驗證差異miRNA 采用qRT-PCR共驗證7個差異miRNA,結(jié)果顯示,蒼耳亭與MHCC97共培養(yǎng)后,外泌體的let-7f-5p、miR-192-5p、miR-197-3p和let-7b-5p表達上調(diào),與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5D),且與外泌體miRNA譜分析結(jié)果相一致。miR-21-5p、miR-483-5p、miR-372-3p的表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

目前肝癌是一種難以治愈的疾病。除早期手術(shù)切除和肝移植外,尚無有效的治療方法。外泌體由多種細胞分泌,包括腫瘤細胞。研究表明腫瘤細胞可以分泌比正常細胞更多的外泌體,外泌體中的miRNAs是參與基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小型非編碼RNAs,可以作為致癌基因或腫瘤抑制因子[10-11]。因此,外泌體中miRNAs不僅與疾病的發(fā)生發(fā)展機制相關(guān),還可能成為較好的腫瘤早期診斷的生物標志物[12]。研究表明,miRNA在HCC細胞和組織中異常表達與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[13]。除miRNAs外,外泌體還通過靶向不同的物質(zhì)(如DNAs、RNAs和蛋白質(zhì))參與HCC發(fā)病機制。

蒼耳亭具有抗腫瘤藥效,能顯著改變腫瘤細胞的外泌體miRNA。蒼耳亭是從蒼耳草中提取分離的天然倍半萜內(nèi)酯,具有顯著的抗腫瘤活性。研究表明,蒼耳亭對人肝癌細胞生長的體外和體內(nèi)影響,其抑瘤率高達45%。蒼耳亭通過調(diào)控Wnt/β-catenin 和EMT相關(guān)蛋白,從而抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[5]。α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯基團為蒼耳亭活性基團結(jié)構(gòu)。它優(yōu)先與JAK2的Cys243、IKK β的Cys412和Cys464相互作用,它們分別是STAT3和NF-κB信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[14]。因此,蒼耳亭優(yōu)先抑制激活STAT3和p65的癌細胞株的生長。本研究結(jié)果與其研究一致,即蒼耳亭作用于腫瘤細胞的外泌體改變了腫瘤細胞的miRNA,這些改變的miRNA作用的信號通路豐富,包括STAT3和NF-κB信號通路。蒼耳亭對人LO2肝細胞無明顯凋亡作用[15]。進一步研究蒼耳亭的抗腫瘤機制對該藥物的開發(fā)利用具有深遠的意義。筆者收集MHCC97H細胞上清液和蒼耳亭共培養(yǎng)過MHCC97H細胞上清液,提取外泌體,通過透射電鏡和Western blotting對外泌體進行鑒定,確認提取的外泌體質(zhì)量。對外泌體miRNAs進行高通量測序,篩選出蒼耳亭共培養(yǎng)MHCC97H細胞中的差異表達的miRNAs。其中,42個下調(diào)miRNAs,36個上調(diào)miRNAs。

蒼耳亭可能通過上調(diào)let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p的表達發(fā)揮治療作用。熒光定量PCR結(jié)果顯示,蒼耳亭共培養(yǎng)后let-7f-5p表達上調(diào),且與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。許多研究表明,抑癌miRNA let-7家族成員在HCC中的表達下調(diào),抑癌miRNA let-7家族成員在HCC中的表達下調(diào),提示let-7可能作為致癌基因參與這一過程[16-18],Let-7b可能通過上調(diào)p21抑制HCC細胞的增殖。下調(diào)血清let-7-a1基因表達可能對埃及慢性HCV患者肝癌的發(fā)生有顯著影響[19]。let-7f-5p在頭頸部癌、轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌中的表達下調(diào)[17,20]。蒼耳亭與MHCC97H細胞共培養(yǎng)后外泌體let-7f-5p表達上調(diào),推測蒼耳亭可能通過調(diào)控let-7f-5p對HCC產(chǎn)生治療作用。Let-7b-5p可抑制肝癌細胞中G2/M的轉(zhuǎn)化。它還能誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡,同時抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移和EMT進展[21]。此外,已有研究報道m(xù)iR-192-5p、miR-197-3p和let-7b-5p在HCC中水平較低,并能抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移[22-23]。miR-192-5p作為TRIP13的上游調(diào)控因子,通過與ACTN4相互作用,AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)肝癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[24]。miR-197-3p可能通過部分下調(diào)ZIK1來調(diào)控HCC細胞的生存[25]。蒼耳亭處理的MHCC97H細胞中l(wèi)et-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p表達上調(diào),推測蒼耳亭可能通過調(diào)控let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p對HCC產(chǎn)生治療作用。miRNA測序結(jié)果上傳至GEO官方網(wǎng)站(GSE172654)。