吳育,汪潔,魏晨旭,張碩,李偉東

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院藥劑科,南通 226000;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州分校,泰州 225300)

侵襲轉(zhuǎn)移是肝癌的基本特征,也是影響肝癌治療效果的關(guān)鍵因素。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者存活率非常低,只有9%患者在診斷后存活>5年[1]。蒼耳亭(xanthatin)是20世紀(jì)60年代從蒼耳(XanthiumstrumariumL.)中分離得到的一種天然倍半萜內(nèi)酯化合物。研究表明,蒼耳亭對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌和皮膚癌等具有顯著的抗腫瘤活性[2-4]。蒼耳亭對(duì)肝癌裸鼠有明顯的抑制腫瘤作用,并且抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)阻礙腫瘤發(fā)展[5-6]。轉(zhuǎn)錄因子Sal樣蛋白4(Sal-like protein-4 ,SALL4)在調(diào)控miR-146a-5p進(jìn)而影響HCC外泌體和M2極化中起到至關(guān)重要的作用[7]。肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103通過(guò)靶向多種內(nèi)皮連接蛋白增加血管通透性并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。

外泌體是直徑30～150 nm的囊泡,由內(nèi)吞過(guò)程產(chǎn)生,并由多囊體(MVBs)與質(zhì)膜融合分泌。幾乎所有類型的細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下都會(huì)釋放外泌體。外泌體是腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境相互作用的重要載體,它攜帶多種生物活性物質(zhì),包括mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)等。腫瘤外泌體可以相互作用,被癌細(xì)胞本身或存在于腫瘤微環(huán)境或遠(yuǎn)離腫瘤部位的其他細(xì)胞所吸收,產(chǎn)生不同的作用[9]。MicroRNAs (miRNAs)越來(lái)越被認(rèn)為是代謝、癌癥、程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞分化等的可行治療靶點(diǎn)。蒼耳亭抗腫瘤是否與腫瘤外泌體有關(guān)筆者尚未見(jiàn)報(bào)道,在本研究通過(guò)高通量miRNAs測(cè)序,篩選蒼耳亭與MHCC97H共培養(yǎng)過(guò)程中差異miRNAs,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,希望為尋找治療肝癌靶點(diǎn)提供有價(jià)值的線索。

1 材料與方法

1.1藥物與試藥 蒼耳亭由南京中醫(yī)藥大學(xué)李偉東教授實(shí)驗(yàn)室提供,經(jīng)過(guò)磁共振及X射線單晶衍射證實(shí)是化合物蒼耳亭,其純度達(dá)98%。人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系MHCC97H購(gòu)于武漢大學(xué)。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM,Sigma-Aldrich,批號(hào):D5796) ;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,BI公司,批號(hào):04-001-1ACS) ;青霉素G 鈉鹽(Sigma-Aldrich 公司,批號(hào):69-57-8) ;硫酸鏈霉素鹽 (AMRESCO 公司,批號(hào):2018382 );二甲亞砜(DMSO,Solarbio公司,批號(hào):D8370)。

1.2儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,型號(hào):3131);超凈工作臺(tái)(ESCO Class ⅡBSC,型號(hào):ESCOAC2);倒置熒光顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司,型號(hào):Vert.A1);電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):BSA224S-CW);測(cè)序分析儀 4000(美國(guó)Illumina公司)。

1.3外泌體的提取和測(cè)定 細(xì)胞MHCC97H培養(yǎng)于含5% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素的DMEM中,在相對(duì)濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在所有實(shí)驗(yàn)中,蒼耳亭均溶解于DMSO中,終濃度5 μmol·L-1。5 μmol·L-1蒼耳亭處理細(xì)胞24 h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組即未共培養(yǎng)的MHCC97H細(xì)胞組(含0.5% DMSO)和蒼耳亭與MHCC97共培養(yǎng)細(xì)胞組。采用差速離心(4 ℃下,500×g離心5 min,200×g離心30 min,10 000×g離心60 min)收集上清液。用孔徑0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器濾過(guò)后,加入超高速離心管中,以4 ℃,120 000×g離心70 min,棄去上清液。最后,根據(jù)沉淀量,加入200～400 μL預(yù)冷無(wú)菌PBS重懸懸液,為高純度EVs。

1.4外泌體的鑒定

1.4.1透射電鏡鑒定外泌體 用PBS 1 mL清洗EVs 3次。加入2%鋨酸溶液0.5 mL,4 ℃固定2 h后沖洗。分別用50%、70%、80%、90%乙醇1 mL,梯度脫水15 min。然后用100%乙醇1 mL脫水2次,每次20 min。用丙酮1 mL置換2次,每次15 min。然后對(duì)其進(jìn)行浸漬、封裝和聚合。清洗過(guò)程依次進(jìn)行乙酸二氧鈾染色和乙酸鉛染色10 min。最后,使用Malvern NanoSight系統(tǒng)檢測(cè)外泌體的顆粒大小。

1.4.2Western blotting鑒定外泌體 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌,在RIPA緩沖液中溶解,RIPA緩沖液中添加1 mmol·L-1PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(Bestbio),稀釋1：100。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度。等量的蛋白樣品(20 μg)通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。

分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。將膜在TBST的脫脂干奶中封閉2 h,在≤4 ℃抗體孵育過(guò)夜:CD9(1：1000)、 HSP70(1：1000)、β-catenin(1：5000)。另一種膜不加抗體TBST溶液孵育作為陰性對(duì)照。反復(fù)洗滌后,將膜與二抗結(jié)合。用TBST再次沖洗膜3次,并使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光襯底。使用圖像分析軟件測(cè)量各波段灰度值進(jìn)行分析。

1.5外泌體的miRNA的分析與驗(yàn)證 外泌體的miRNA的測(cè)序借助研載生物技術(shù)(上海)有限公司平臺(tái)完成。用TRIzol試劑提取總RNA,用聚丙烯酰胺凝膠電泳富集18 ～ 30 nt的RNA分子。然后,富集36～44 nt RNAs,用PCR提取試劑盒純化cDNA片段,形成cDNA文庫(kù)。結(jié)扎產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選,PCR擴(kuò)增,文庫(kù)借助上海研載生物技術(shù)有限公司的HiSeq 4000 (Illumina)機(jī)器進(jìn)行深度測(cè)序。差異miRNAs篩選條件為|log2FoldChange|≥0.58和P<0.05。差異miRNAs的潛在靶基因由miRNA DA預(yù)測(cè),并基于數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)、GO網(wǎng)站 (http://www.geneontology.org/)和KEGG網(wǎng)站(http://www.genome.jp/kegg/)。利用熱圖對(duì)歸一化聚類數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換,繪制熱圖。

1.6采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行差異miRNAs驗(yàn)證 分別從MHCC97H細(xì)胞組和蒼耳亭共培養(yǎng)的MHCC97H細(xì)胞組中提取外泌體的總RNA,使用PrimeScript RT試劑盒(TAKARA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用Roche LightCycler 480 II PCR體系與SYBR Green(TAKARA)進(jìn)行qRT-PCR。U6和ccel-miR-39分別作為miRNAs的內(nèi)參和外參。

2 結(jié)果

2.1外泌體的確證 MHCC97H組和蒼耳亭+MHCC97H組腫瘤外泌體粒徑分別為(145.5±40.8)和(147.2±41.1)nm。透射電鏡觀察顯示外泌體呈杯狀結(jié)構(gòu),直徑在正常范圍內(nèi)。Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示CD9和HSP70表達(dá)呈陽(yáng)性,進(jìn)一步證實(shí)純化后的囊泡為外泌體(圖1)。

A.外泌體顆粒尺寸大小;B.透射電鏡觀察外泌體形態(tài);C.免疫印跡法檢測(cè)外泌體的陽(yáng)性生物標(biāo)志物CD9和HSP70。

2.2外泌體miRNA譜分析 測(cè)序結(jié)果顯示,共鑒定出已知miRNAs497個(gè),未被命名的miRNAs 510個(gè)。基因組比對(duì)率75.21%～81.78%,已知miRNA比對(duì)率0.59%～0.65%。與對(duì)照組比較,蒼耳亭處理的MHCC97H細(xì)胞中共鑒定出78個(gè)差異miRNAs,其中36個(gè)上調(diào)miRNA,42個(gè)下調(diào)miRNA(圖2)。熱圖顯示,這些差異miRNAs能夠區(qū)分蒼耳亭共培養(yǎng)的MHCC97H細(xì)胞組和MHCC97H細(xì)胞組(圖3)。

圖2 蒼耳亭處理MHCC97H細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜火山圖

紅色表示高表達(dá);藍(lán)色表示低表達(dá)。

2.3外泌體miRNA功能分析 對(duì)差異miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),將其映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中,并進(jìn)行比較(圖4A)。GO數(shù)據(jù)庫(kù)主要從“生物過(guò)程”“細(xì)胞組成”和“分子功能”三方面進(jìn)行了分析。“生物過(guò)程”方面,基因主要與“細(xì)胞過(guò)程”“代謝過(guò)程”和“單一的生物過(guò)程”有關(guān)?！凹?xì)胞過(guò)程”方面,基因主要與“細(xì)胞成分”和“細(xì)胞器組成”有關(guān)?！胺肿庸δ堋狈矫?基因主要與“結(jié)合”和“催化活性”有關(guān)(圖4B)。

圖4 差異miRNA靶基因和所有GO基因的分布情況

2.4KEGG信號(hào)通路富集分析 KEGG對(duì)差異miRNAs靶基因的功能進(jìn)行分類,富集出前20條作用的信號(hào)通路(圖5A-B)。結(jié)果顯示前20條通路,包括“癌癥通路”“鈣離子信號(hào)通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“黏連信號(hào)通路”。根據(jù)miRNA測(cè)序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)510個(gè)未被命名的miRNA,其中對(duì)照組發(fā)現(xiàn)287個(gè)未命名miRNA,蒼耳亭治療組發(fā)現(xiàn)354個(gè)未命名miRNA。KEGG富集分析顯示,差異miRNAs的靶基因主要集中在“鈣離子信號(hào)通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“Ras信號(hào)通路”“cAMP信號(hào)通路”和“癌癥通路”(圖5C)。

A.KEGG分析miRNA靶基因的分布圖;B.KEGG分析差異miRNA靶基因分布圖;C.KEGG富集分析差異miRNA的TOP20信號(hào)通路圖;P值越小,顏色越傾向于紅色,點(diǎn)越大,表示通路中的基因越多;D.qRT-PCR驗(yàn)證差異miRNA表達(dá)水平;①與對(duì)照組比較,P<0.05;②與對(duì)照組比較,P<0.01。

2.5qRT-PCR驗(yàn)證差異miRNA 采用qRT-PCR共驗(yàn)證7個(gè)差異miRNA,結(jié)果顯示,蒼耳亭與MHCC97共培養(yǎng)后,外泌體的let-7f-5p、miR-192-5p、miR-197-3p和let-7b-5p表達(dá)上調(diào),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5D),且與外泌體miRNA譜分析結(jié)果相一致。miR-21-5p、miR-483-5p、miR-372-3p的表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

目前肝癌是一種難以治愈的疾病。除早期手術(shù)切除和肝移植外,尚無(wú)有效的治療方法。外泌體由多種細(xì)胞分泌,包括腫瘤細(xì)胞。研究表明腫瘤細(xì)胞可以分泌比正常細(xì)胞更多的外泌體,外泌體中的miRNAs是參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小型非編碼RNAs,可以作為致癌基因或腫瘤抑制因子[10-11]。因此,外泌體中miRNAs不僅與疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制相關(guān),還可能成為較好的腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物[12]。研究表明,miRNA在HCC細(xì)胞和組織中異常表達(dá)與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[13]。除miRNAs外,外泌體還通過(guò)靶向不同的物質(zhì)(如DNAs、RNAs和蛋白質(zhì))參與HCC發(fā)病機(jī)制。

蒼耳亭具有抗腫瘤藥效,能顯著改變腫瘤細(xì)胞的外泌體miRNA。蒼耳亭是從蒼耳草中提取分離的天然倍半萜內(nèi)酯,具有顯著的抗腫瘤活性。研究表明,蒼耳亭對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體外和體內(nèi)影響,其抑瘤率高達(dá)45%。蒼耳亭通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 和EMT相關(guān)蛋白,從而抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[5]。α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯基團(tuán)為蒼耳亭活性基團(tuán)結(jié)構(gòu)。它優(yōu)先與JAK2的Cys243、IKK β的Cys412和Cys464相互作用,它們分別是STAT3和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[14]。因此,蒼耳亭優(yōu)先抑制激活STAT3和p65的癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與其研究一致,即蒼耳亭作用于腫瘤細(xì)胞的外泌體改變了腫瘤細(xì)胞的miRNA,這些改變的miRNA作用的信號(hào)通路豐富,包括STAT3和NF-κB信號(hào)通路。蒼耳亭對(duì)人LO2肝細(xì)胞無(wú)明顯凋亡作用[15]。進(jìn)一步研究蒼耳亭的抗腫瘤機(jī)制對(duì)該藥物的開(kāi)發(fā)利用具有深遠(yuǎn)的意義。筆者收集MHCC97H細(xì)胞上清液和蒼耳亭共培養(yǎng)過(guò)MHCC97H細(xì)胞上清液,提取外泌體,通過(guò)透射電鏡和Western blotting對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定,確認(rèn)提取的外泌體質(zhì)量。對(duì)外泌體miRNAs進(jìn)行高通量測(cè)序,篩選出蒼耳亭共培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞中的差異表達(dá)的miRNAs。其中,42個(gè)下調(diào)miRNAs,36個(gè)上調(diào)miRNAs。

蒼耳亭可能通過(guò)上調(diào)let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p的表達(dá)發(fā)揮治療作用。熒光定量PCR結(jié)果顯示,蒼耳亭共培養(yǎng)后let-7f-5p表達(dá)上調(diào),且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。許多研究表明,抑癌miRNA let-7家族成員在HCC中的表達(dá)下調(diào),抑癌miRNA let-7家族成員在HCC中的表達(dá)下調(diào),提示let-7可能作為致癌基因參與這一過(guò)程[16-18],Let-7b可能通過(guò)上調(diào)p21抑制HCC細(xì)胞的增殖。下調(diào)血清let-7-a1基因表達(dá)可能對(duì)埃及慢性HCV患者肝癌的發(fā)生有顯著影響[19]。let-7f-5p在頭頸部癌、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)下調(diào)[17,20]。蒼耳亭與MHCC97H細(xì)胞共培養(yǎng)后外泌體let-7f-5p表達(dá)上調(diào),推測(cè)蒼耳亭可能通過(guò)調(diào)控let-7f-5p對(duì)HCC產(chǎn)生治療作用。Let-7b-5p可抑制肝癌細(xì)胞中G2/M的轉(zhuǎn)化。它還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,同時(shí)抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和EMT進(jìn)展[21]。此外,已有研究報(bào)道m(xù)iR-192-5p、miR-197-3p和let-7b-5p在HCC中水平較低,并能抑制HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[22-23]。miR-192-5p作為TRIP13的上游調(diào)控因子,通過(guò)與ACTN4相互作用,AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[24]。miR-197-3p可能通過(guò)部分下調(diào)ZIK1來(lái)調(diào)控HCC細(xì)胞的生存[25]。蒼耳亭處理的MHCC97H細(xì)胞中l(wèi)et-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p表達(dá)上調(diào),推測(cè)蒼耳亭可能通過(guò)調(diào)控let-7f-5p、let-7b-5p、miR-192-5p和miR-197-3p對(duì)HCC產(chǎn)生治療作用。miRNA測(cè)序結(jié)果上傳至GEO官方網(wǎng)站(GSE172654)。