陳紅,邱雯,吉興芳,王志鵬,駱平英,劉海艷

(1.成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,成都 610057;2.蘭州大學第二醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構(gòu),蘭州 730030;3.蘭州大學藥學院,蘭州 730030;4.湖南科銳斯醫(yī)藥科技有限公司,長沙 410205)

慢性乙型肝炎(簡稱乙肝)是一種影響全球公共衛(wèi)生的傳染病,由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)持續(xù)感染導致的常見慢性肝臟疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,截至2019年,全球慢性HBV感染者約2.5億例[1]。目前,慢性乙肝已成為我國社會負擔最大的疾病之一[1]。富馬酸丙酚替諾福韋(tenofovir alafenamide fumarate,TAF)作為近10年批準用于治療慢性乙肝的第一個藥物,通過被動擴散以及肝臟攝取性轉(zhuǎn)運體OATP1B1和OATP1B3進入原代肝細胞。丙酚替諾福韋主要通過羧酸酯酶1水解形成替諾福韋,隨后經(jīng)過磷酸化,形成藥理學活性代謝產(chǎn)物二磷酸替諾福韋。二磷酸替諾福韋借助HBV逆轉(zhuǎn)錄酶整合嵌入病毒DNA(這會導致DNA鏈終止),從而抑制HBV復制[2-4]。目前,關(guān)于替諾福韋的血藥濃度測定及藥動學研究報道較少[5-9],丙酚替諾福韋在健康中國志愿者體內(nèi)藥動學呈現(xiàn)高變異性[10]。筆者在本研究建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測定丙酚替諾福韋及其代謝物替諾福韋濃度,評價TAF片國內(nèi)仿制藥與國外原研藥的生物等效性。報道如下。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 受試制劑:TAF片(成都倍特藥業(yè)有限公司,規(guī)格:每片25 mg,批號:180101,含量:99.6%);參比制劑:TAF片(商品名:Vemlidy?,Gilead Sciences公司,規(guī)格:每片25 mg,批號:011928,含量:96.9%);TAF對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:430025-202101);替諾福韋對照品(AOCS公司,批號:EST-007-15-E);阿哌沙班(內(nèi)標,HST公司,批號:A009000-201905);外消旋替諾福韋-d6(內(nèi)標,TRC,批號:12-JLI-109-1)。甲醇、乙腈(色譜純,Merck公司),乙酸、乙酸銨、異丙醇(質(zhì)譜純,ACS公司),其余試劑均為分析純。

1.2儀器 LC-20AD型UPLC系統(tǒng)(日本Shimadzu公司,配有LC-20AD型高壓恒流輸液泵、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A控制器、DGU-20A3脫氣機、SIL-30AC MP進樣器);LCMS-8050三重四級桿質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司);Labsolution數(shù)據(jù)采集工作站;電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,感量:0.01 mg);ULTS1490型超低溫冰箱(美國Thermo Scientific公司);TGL16M、TGL18型離心機(長沙英泰儀器有限公司)。

1.3受試者選擇 本研究共入組中國健康受試者68例。其中空腹試驗入組32例,男21例,女11例,年齡(21.71±1.64)歲,身高(165.63±8.24)cm,體質(zhì)量(59.23±7.29)kg,體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(21.53±1.47)kg·(m2)-1。餐后試驗入組36例,男22例,女14例,年齡(22.39±2.98)歲,身高(168.22±7.60)cm,體質(zhì)量(61.83±7.23)kg,BMI為(21.80±1.48)kg·(m2)-1。所有受試者性別、年齡、身高、體質(zhì)量等人口學特征均符合入組要求,受試者在試驗前14 d及試驗期間未曾服用過任何其他藥物。試驗前受試者均簽署知情同意書,自愿參加,服藥的依從性良好,本試驗方案經(jīng)蘭州大學第二醫(yī)院藥物臨床試驗倫理委員會批準(倫理批件號:[2018]第20號、21號)。

1.4給藥方案與血樣采集 本試驗采用隨機、開放、兩制劑、兩序列、四周期、完全重復交叉的生物等效性試驗設(shè)計,每周期清洗期為14 d。所有受試者于試驗前1 d入住病房,統(tǒng)一生活管理,禁服茶、咖啡及其他含咖啡和醇類飲料,并禁止吸煙。試驗當天早上隨機發(fā)放受試制劑或參比制劑,受試者在端坐姿態(tài)下空腹單次口服用藥(至少空腹10 h),餐后組在服藥前30 min開始進食高脂餐,30 min內(nèi)進餐完畢,溫開水240 mL送服。服藥前后1 h內(nèi)禁止飲水(服藥時飲水240 mL除外),服藥4 h內(nèi)禁食。服藥4,10 h后統(tǒng)一進標準餐。受試者服藥后應(yīng)避免劇烈運動,亦不得長時間臥床。

空腹和餐后試驗組分別在給藥前(0 h)以及給藥后5,10,20,30,40,50 min及1,1.25,1.5,1.75,2,2.5,3,4,5,6,8,12,24,48,72 h,采集前臂靜脈血3 mL,置于肝素鈉抗凝管中,輕柔顛倒混勻。采集的血樣在30 min內(nèi)4 ℃條件下離心(2000×g,10 min),離心后取上層血漿0.8 mL,轉(zhuǎn)移至含2%乙酸16 μL的凍存管中,混勻5 s后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。血樣采集前以及血樣采集后到低溫離心操作之前,真空采血管均須置于冰水浴內(nèi)。分取血漿過程中及分取血漿后到置于冰箱之前的過程中,凍存管均置于冰水浴內(nèi)。

1.5測定方法

1.5.1色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×75 mm,1.8 μm);流動相A:5 mmol·L-1乙酸銨(含0.1%甲酸),流動相B:甲醇：乙腈(1：1);梯度洗脫(丙酚替諾福韋:0.01～0.40 min,15% B;1.00～2.50 min,95% B;2.60～3.80 min,15% B。替諾福韋:0.01～0.50 min,1% B;0.60～2.50 min,12% B;3.00～4.00 min,90% B;4.30～6.00 min,1% B);流速:0.3 mL·min-1;柱溫40 ℃;進樣量5.0 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 離子源:ESI,離子化方式:正離子模式;掃描方式:MRM;監(jiān)測離子對:丙酚替諾福韋(m/z)為477.05/346.10,阿哌沙班(內(nèi)標,m/z)為460.05/443.00,替諾福韋為(m/z)288.10/176.10,替諾福韋-d6(內(nèi)標,m/z)為294.40/181.95;接口溫度:400 ℃,DL溫度:250 ℃,加熱塊溫度:400 ℃,接口電壓:4.5 kV。

1.5.3對照品儲備液的制備 精密稱取適量TAF對照品置于棕色玻璃瓶中,甲醇溶解并定容,配制成含丙酚替諾福韋10.00 mg·mL-1的儲備液;精密稱取適量替諾福韋對照品置于透明玻璃瓶中,溶解于適量體積水中,配制成含替諾福韋1.000 mg·mL-1的儲備液。在2～8 ℃條件下保存。

1.5.4內(nèi)標工作溶液的制備 精密稱取阿哌沙班對照品適量,加入適量二甲亞砜(DMSO)溶解并搖勻,再加入等量甲醇稀釋,用乙腈稀釋至10.00 ng·mL-1;精密稱取替諾福韋-d6,加入適量DMSO溶解并搖勻,將其用甲醇稀釋至10.00 ng·mL-1。2～8 ℃保存。

1.5.5標準曲線溶液的制備 取適量丙酚替諾福韋儲備液,用甲醇-水(50：50)逐漸稀釋,配制成標準曲線溶液,將其加入空白人血漿中(含2%乙酸)稀釋,得到濃度為1.000,2.500,10.00,20.00,40.00,100.0,200.0,400.0 ng·mL-1的系列校正標樣。取適量替諾福韋儲備液,用甲醇-水(50：50)逐漸稀釋,配制成標準曲線溶液,將其加入空白人血漿(含2%乙酸)中稀釋,得到濃度為0.400 0,0.800 0,2.000,5.000,10.00,20.00,32.00,40.00 ng·mL-1的系列校正標樣。

1.5.6血漿樣品前處理 ①丙酚替諾福韋:吸取待測血漿樣品80.0 μL至1.5 mLEP管中,加入阿哌沙班內(nèi)標工作液(雙空白樣品替換為純乙腈)500 μL,渦旋振蕩3 min后,于4 ℃、12 000 r·min-1(2000×g)條件下離心10 min,取上清液50.0 μL至96孔進樣板,加入純水稀釋液150 μL,混勻后進樣分析。②替諾福韋:吸取待測血漿樣品100 μL至1.5 mL EP管中,加入替諾福韋-d6內(nèi)標工作液(雙空白樣品替換為純甲醇)300 μL,渦旋振蕩3 min,于4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心10 min,取上清液150.0 μL至96孔進樣板,加入純水稀釋液150 μL,混勻后進樣分析。

1.5.7統(tǒng)計學方法 利用WinNonlin軟件,采用非房室模型法(non-compartment model,NCA)計算丙酚替諾福韋與替諾福韋藥動學參數(shù),并采用平均生物等效性或參比制劑標度的平均生物等效性置信區(qū)間法進行評價。利用SPSS 23.0版軟件,采用獨立樣本t檢驗法分析不同性別的受試者之間主要藥動學參數(shù)峰濃度(Cmax),血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)及AUC0-∞之間的差異,采用非參數(shù)檢驗法比較不同性別受試者之間達峰時間(tmax)之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1方法學考察及評價

2.1.1選擇性 取6個不同來源的空白血漿,按照“1.5.6”項血漿樣品前處理中雙空白樣品進行處理后進樣。要求雙空白樣品中待測物峰面積不超過定量下限樣品待測物峰面積的20%,內(nèi)標峰面積不超過定量下限樣品內(nèi)標峰面積的5%。在本研究條件下,丙酚替諾福韋保留時間約為2.25 min,替諾福韋保留時間約為2.35 min,內(nèi)標阿哌沙班保留時間約為2.25 min,替諾福韋-d6保留時間約為2.35 min。結(jié)果表明,空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾代謝物和內(nèi)標的測定,色譜圖見圖1,圖2。

A.空白血漿;B.定量下限(1.000 ng·mL-1);C.定量上限(400.0 ng·mL-1)。

A.空白血漿;B.定量下限(0.400 0 ng·mL-1);C.定量上限(40.00 ng·mL-1)。

2.1.2標準曲線及定量限 使用空白人血漿新鮮制備下列濃度的血漿樣品,丙酚替諾福韋:1.000,2.500,10.00,20.00,40.00,100.0,200.0,400.0 ng·mL-1,替諾福韋:0.400 0,0.800 0,2.000,5.000,10.00,20.00,32.00,40.00 ng·mL-1,對響應(yīng)值Y(分析物與內(nèi)標的峰面積比值)與分析物理論濃度(C)進行線性回歸,權(quán)重為1/C2。丙酚替諾福韋在1.000～400.0 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好(R2>0.98),標準曲線:Y=0.012 654X-0.000 491 645;替諾福韋在0.4000～40.00 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好(R2>0.98),標準曲線:Y=0.101 627X-0.005 181 01。

2.1.3精密度及準確度 使用空白人血漿新鮮制備定量下限、低、中、高共4個濃度的血漿樣品,每個濃度各6份,按照“1.5.6”項血漿樣品前處理后測定,至少2 d內(nèi)連續(xù)測定3個批次。以單個分析批內(nèi)測得濃度計算批內(nèi)精密度及準確度,以3個分析批測得濃度數(shù)據(jù)計算批間精密度及準確度,結(jié)果見表1。

表1 丙酚替諾福韋及替諾福韋精密度及準確度考察結(jié)果

2.1.4基質(zhì)效應(yīng) 分別取6個不同來源的空白人血漿(含2%乙酸),按照“1.5.6”項雙空白樣品進行處理,向其中添加低、中、高濃度分析物及內(nèi)標制得基質(zhì)樣品,每個濃度重復6份。另配制低、中、高濃度純?nèi)芤簶悠?。對比基質(zhì)樣品與純?nèi)芤褐g的內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。結(jié)果丙酚替諾福韋及替諾福韋低、中、高3個濃度水平,內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子變異系數(shù)均≤15%,表明在本研究條件下,各樣品的基質(zhì)效應(yīng)均一。

2.1.5穩(wěn)定性 血漿穩(wěn)定性結(jié)果見表2。丙酚替諾福韋:儲備液(甲醇配制)室溫存放19 h穩(wěn)定,工作溶液(50%甲醇水配制)室溫存放41 h穩(wěn)定。血漿樣品室溫21 h穩(wěn)定,-80 ℃凍融3次穩(wěn)定,制備后樣品2～8 ℃存放73 h穩(wěn)定。替諾福韋:工作溶液(50%甲醇水配制)室溫存放41 h穩(wěn)定;血漿樣品室溫44 h穩(wěn)定,-80 ℃凍融3次穩(wěn)定,制備后樣品2～8 ℃存放116 h穩(wěn)定。

表2 丙酚替諾福韋及替諾福韋血漿穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.2藥動學 本試驗共入組68例受試者(空腹32例,脫落3例;餐后36例),共65例受試者完成試驗。試驗過程中未發(fā)生對受試者安全與權(quán)益、數(shù)據(jù)科學性評價有影響的方案偏離或違背。本試驗未發(fā)生嚴重不良事件,9例(24.32%)受試者發(fā)生10例次不良事件,均為輕度。不良事件的組織器官和系統(tǒng)歸類主要為各類檢查、血液及淋巴系統(tǒng)疾病、各類神經(jīng)系統(tǒng)疾病和代謝及營養(yǎng)類疾病等,首選術(shù)語主要為貧血、頭暈和高尿酸血癥等。

不同性別健康受試者空腹或餐后單次口服TAF片25 mg后,丙酚替諾福韋體內(nèi)暴露存在顯著性別差異,主要藥動學參數(shù),見表3～4。如AUC0-t和AUC0-∞經(jīng)t檢驗,P值均<0.01。

表3 健康受試者空腹單次口服TAF片后丙酚替諾福韋和替諾福韋主要藥動學參數(shù)

表4 健康受試者餐后單次口服TAF片后丙酚替諾福韋和替諾福韋主要藥動學參數(shù)

受試者在空腹和高脂餐后服用TAF片25 mg,丙酚替諾福韋和替諾福韋平均血藥濃度-時間曲線見圖3,4,藥動學參數(shù)見表5,6。

表5 空腹試驗和餐后試驗健康受試者體內(nèi)丙酚替諾福韋的主要藥動學參數(shù)

表6 空腹試驗和餐后試驗健康受試者體內(nèi)替諾福韋的主要藥動學參數(shù)

圖3 健康受試者口服TAF片25 mg后丙酚替諾福韋血藥濃度-時間曲線

圖4 健康受試者口服TAF片25 mg后替諾福韋血藥濃度-時間曲線

表7 丙酚替諾福韋及其代謝物替諾福韋的生物等效性結(jié)果

3 討論

本試驗首次考察性別對丙酚替諾福韋及其代謝物替諾福韋在健康中國人體內(nèi)藥動學特征的影響。研究結(jié)果表明(表3),在空腹條件下口服TAF片25 mg后,女性受試者體內(nèi)丙酚替諾福韋暴露量(AUC)明顯高于男性(P<0.01),男性受試者約為女性受試者的62%。男女性受試者Cmax比較亦差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),男性受試者Cmax約為女性受試者的61%。tmax及半衰期未表現(xiàn)出明顯的差異。代謝物替諾福韋的主要藥動學參數(shù)在不同性別受試者間均未表現(xiàn)出明顯的差異。

原研藥說明書采用群體藥動學的方法評估不同影響因素對丙酚替諾福韋的藥動學參數(shù)的影響,結(jié)果未將性別列出的藥動學差異視為具有臨床相關(guān)性。然而,本研究結(jié)果提示中國健康女性受試者在空腹服用相同劑量的丙酚替諾福韋制劑后,原型藥物體內(nèi)暴露存在顯著性別差異。因原形藥物在女性受試者中具有更高的暴露,增加女性患者發(fā)生臨床不良反應(yīng)風險,提示在此類藥物對臨床研究中應(yīng)關(guān)注女性受試者的安全。

試驗發(fā)現(xiàn)與空腹給藥比較,餐后給藥丙酚替諾福韋暴露量AUC0-t增加55.19%,Cmax降低10.51%,且tmax推遲約0.41 h,而代謝物替諾福韋Cmax降低15.73%,tmax推遲約0.75 h,AUC0-t基本無明顯變化,說明飲食對富馬酸替諾福韋的藥動學存在明顯影響,結(jié)果與國內(nèi)外文獻報道結(jié)果一致[11-12]。

本研究在健康中國成年受試者中采用隨機、開放、兩制劑、兩序列、四周期、完全重復交叉試驗,證明空腹和餐后條件下單次口服富馬酸丙酚替諾福韋受試制劑和參比制劑具有生物等效性。此外,本研究發(fā)現(xiàn)性別對替諾福韋艾拉酚胺在健康中國人體內(nèi)藥動學特征的影響,但其代謝物替諾福韋的主要藥動學參數(shù)在不同性別受試者間均未表現(xiàn)出明顯的差異。同時,飲食也會對丙酚替諾福韋及其代謝物替諾福韋在健康中國人體內(nèi)藥動學特征產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果可為富馬酸替諾福韋在中國人群的安全合理用藥提供重要參考依據(jù)。