梅小平,翟陽(yáng),王凱華,滕紅麗,鄭光珊,楊鵬,鄒敏

(1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院醫(yī)務(wù)部,南寧 530200;2.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院腦病科,南寧 530200;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530200;4.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院科技部,南寧 530200;5.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院兒科,南寧 530200)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種具有高發(fā)病率和高死亡率的常見(jiàn)疾病[1]。目前,靜脈溶栓和取栓是IS的首選治療手段[2]。然而,血流恢復(fù)后,往往導(dǎo)致缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷,進(jìn)一步加重腦損傷,目前仍無(wú)有效的治療方法。神經(jīng)保護(hù)作用是指抑制神經(jīng)元凋亡以挽救缺血半影區(qū)神經(jīng)功能。因此,開(kāi)發(fā)能夠抑制缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡的治療劑已成為該領(lǐng)域的一項(xiàng)重要任務(wù)。細(xì)胞凋亡和自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的兩個(gè)重要細(xì)胞過(guò)程。自噬是真核細(xì)胞用于降解長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器的主要調(diào)節(jié)分解代謝機(jī)制,介導(dǎo)細(xì)胞存活和凋亡[3-4]。現(xiàn)代研究表明細(xì)胞凋亡[5-6]是IS的重要病理特征之一,IS引起的腦I/R損傷病理機(jī)制(如神經(jīng)元凋亡)與自噬有關(guān)[7],自噬對(duì)IS具有雙向作用,通過(guò)調(diào)節(jié)自噬可抑制神經(jīng)元凋亡減輕腦損傷[4]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target rapamycin,mTOR)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)腦I/R后的自噬激活,是一種通過(guò)調(diào)節(jié)自噬來(lái)治療腦I/R損傷的新型治療靶點(diǎn)。研究顯示,AMPK/mTOR可通過(guò)Unc-51樣激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1)的磷酸化調(diào)節(jié)腦I/R誘導(dǎo)的自噬[8-9]。雙路通腦方由廣西特色壯藥(如扶芳藤、黃花倒水蓮、田七、茯苓等)配伍而成,治療IS療效顯著,能改善患者的神經(jīng)功能,提高生活質(zhì)量[10]。雙路通腦方在腦缺血損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的證據(jù)以及其對(duì)IS的改善作用是否與AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)尚不完全清楚。因此,本研究基于AMPK/mTOR信號(hào)通路探討壯藥雙路通腦方對(duì)腦I/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元自噬和凋亡的影響,以期為雙路通腦方在IS等腦部疾病中的應(yīng)用提供進(jìn)一步的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠108只,體質(zhì)量250～300 g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2020-0005。所有大鼠均保持在相對(duì)濕度(50%～70%)和溫度(25±2)℃的環(huán)境中,明暗循環(huán)為12 h：12 h。術(shù)前所有大鼠禁食12 h。

1.2藥物與試劑 雙路通腦方組成:扶芳藤20 g、黃花倒水蓮15 g、田七15 g、茯苓15 g、法半夏20 g、蒼術(shù)15 g、桂枝尖15 g、南山楂20 g、肉蓯蓉15 g、陳皮15 g、生姜15 g、火麻仁15 g、炙甘草5 g,以上中藥飲片來(lái)源于廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院,批號(hào)依次為20210101,20200601,20200901,20210102,20201102,20201201,20200602,20200901,20200701,20210101,20210401,20210101和20201201,并經(jīng)廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部黃琳蕓副主任中藥師鑒定均為正品。按常規(guī)方法煎煮、過(guò)濾,并濃縮至每毫升含原藥材2 g。AMPK激活劑阿卡地新(acadesine,AICAR)(美國(guó)MedChemExpress公司,批號(hào):HY-13417,含量:99.71%);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液(北京Solarbio公司,批號(hào):G3005,含量:2%);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào):C0105S)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):C1086,綠色熒光)、DAPI染色液(批號(hào):C1006)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔源一抗LC3B(批號(hào):ab48394)、Beclin-1(批號(hào):ab207612)、p62(批號(hào):ab155686)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC-3)A/B(#4108)、AMPK(#5831)、p-AMPK(#2535)、mTOR(#2972)、p-mTOR(#5536)、ULK1(#8054)、p-ULK1(Ser757,#14202)、p-ULK1(Ser317,#37762)和山羊抗兔IgG二抗(#14708)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.3儀器 BX61電動(dòng)顯微鏡(日本Olympus公司);Hitachi H-7650透射電子掃描顯微鏡(日本日立公司);TCS SP5共聚焦激光掃描顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組、給藥與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組和小、中、大劑量雙路通腦方組及大劑量雙路通腦方+AICAR組,每組18只。采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型[11]。首先,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液3 mL·kg-1對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。然后,在頸部右側(cè)做一個(gè)2 cm的縱向切口,分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈,于頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一“V”形小切口。將線栓通過(guò)此切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈,然后輕輕朝向Willis環(huán)推進(jìn)18～22 mm,遇到阻力后停止。缺血2 h后緩慢拉出線栓以允許再灌注。假手術(shù)組不插線栓,僅分離血管。手術(shù)期間使用溫度調(diào)節(jié)的加熱墊將直腸溫度控制在(37±0.5) ℃。待大鼠清醒后,采用5級(jí)評(píng)分法對(duì)其神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分為1～3分的大鼠納入研究。

MCAO術(shù)前,小、中、大劑量雙路通腦方組和大劑量雙路通腦方+AICAR組灌胃給予相應(yīng)劑量雙路通腦方煎液,每天1次,連續(xù)7 d。假手術(shù)組及模型對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃;大劑量雙路通腦方+AICAR組在造模前60 min腹腔注射AICAR 50 mg·kg-1[12]。劑量換算:根據(jù)人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算藥物的等效劑量(大鼠的日劑量相當(dāng)于成人的6.3倍)。成人平均體質(zhì)量按70 kg計(jì),成人每日雙路通腦方的給藥劑量相當(dāng)于生藥200 g,換算成大鼠的日給藥劑量為200 g/70 kg×6.3=18.0 g·kg-1,因此設(shè)置9.0,18.0,36.0 g·kg-1為小、中、大劑量。

1.5神經(jīng)功能缺損評(píng)分 在大鼠清醒后和MCAO術(shù)后24 h,一名對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)不知情的研究人員評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損的程度。采用5級(jí)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估[13]。0分:沒(méi)有明顯的神經(jīng)功能缺損;1分:對(duì)側(cè)前爪未完全伸直;2分:向?qū)γ姹P旋;3分:跌倒對(duì)側(cè);4分:無(wú)法行走。

1.6TTC染色檢測(cè)腦梗死體積 MCAO術(shù)后24 h評(píng)估梗死體積。每組按照隨機(jī)數(shù)字表法選取大鼠6只,取出腦組織并在-20 ℃下冷凍30 min,然后切成2 mm厚的冠狀切片,并在2% TTC中于37 ℃下孵育30 min。每個(gè)切片在4%多聚甲醛中浸泡24 h,然后攝像。Image J軟件用于分析梗死區(qū)域,計(jì)算梗死率。梗死率(%)=梗死腦組織(白色)體積/對(duì)側(cè)大腦半球體積×100%。

1.7HE染色觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 每組按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取大鼠6只,取腦組織并將其冠狀切分為兩部分,一部分將海馬CA1區(qū)切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊,并在4 ℃下固定在2.5%戊二醛中;另一部分用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,并將切片放置在載玻片上進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察缺血半影區(qū)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

1.8TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 取腦組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化后將切片用蛋白酶K溶液(20 μg·mL-1)在37 ℃下透化30 min,然后用3%過(guò)氧化氫(H2O2)溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和熒光素添加到切片中,并在37 ℃下避光孵育2 h。隨后,用DAPI將細(xì)胞核染色?？篃晒獯銣鐒┓馄?用熒光顯微鏡觀察切片并拍攝圖像。Image-Pro Plus 6.0版軟件用于量化TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量,計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。AI(%)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.9透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察自噬小體的形成 將固定在2.5%戊二醛中腦組織塊用PBS洗滌后,在4 ℃下浸入1%四氧化鋨中2 h。然后,將組織塊在分級(jí)乙醇溶液中脫水并包埋在環(huán)氧樹(shù)脂中,然后將塊切成超薄切片(厚度60～70 nm),用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后,使用TEM觀察自噬小體的形成情況。

1.10免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色檢測(cè)LC3-Ⅱ的表達(dá) 將腦組織切片(厚度5 μm)脫蠟、水化后進(jìn)行抗原修復(fù)。然后,用3% H2O2孵育10 min滅活,以內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,5%牛血清白蛋白封閉后,與兔源LC3B一抗(1：200)在4 ℃下孵育過(guò)夜。用PBS沖洗后,切片與山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗(1：200)在室溫下孵育2 h。細(xì)胞核用DAPI染色。用抗熒光淬滅劑封固后,在熒光顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元中LC3-Ⅱ的陽(yáng)性表達(dá),并計(jì)算LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity,MFI)。

1.11Western blotting檢測(cè)自噬標(biāo)志基因Beclin-1、LC3A/B、p62及AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 每組剩余大鼠6只,取腦后分離海馬組織,在冰冷的RIPA裂解液中裂解10 min,12 000×g離心15 min。通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropho-resis,SDS-PAGE)分離等量的總蛋白。之后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。在室溫下將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h,然后與一抗LC3A/B(1：1000)、Beclin-1(1：2000)、p62(1：1000)、AMPK(1：1000)、p-AMPK(1：500)、mTOR(1：1000)、p-mTOR(1：500)、ULK1(1：1000)、p-ULK1(S757)(1：1000)、p-ULK1(S317)(1：1000)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(1：2000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后,將膜與辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG二抗(1：3000)在室溫下孵育1 h。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑顯影后,使用Image J軟件測(cè)量目標(biāo)蛋白的灰度值。GAPDH用作上樣對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 與假手術(shù)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分0分比較,模型對(duì)照組神經(jīng)功能缺損評(píng)分(2.89±0.30)顯著升高(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為(2.46±0.27),(2.01±0.22),(1.50±0.18),均顯著降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組神經(jīng)功能缺損評(píng)分為(2.62±0.29),顯著升高(P<0.05)。

2.2大鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組梗死體積比為0%比較,模型對(duì)照組腦梗死體積(32.16±2.57)%,顯著升高(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組腦梗死體積分別為(24.58±2.39)%,(17.43±2.12)%,(9.81±1.45)%,均顯著降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組腦梗死體積(28.50±2.36)%,顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A:假手術(shù)組;B:模型對(duì)照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.3大鼠神經(jīng)元病理?yè)p傷的影響 HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組缺血半影區(qū)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,排列整齊,細(xì)胞核完整;模型對(duì)照組缺血半影區(qū)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞膜破壞,細(xì)胞形態(tài)腫脹,大量神經(jīng)元丟失死亡,核部分溶解固縮;與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組缺血半影區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)則,有少數(shù)神經(jīng)元退化壞死,核固縮、細(xì)胞膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞得到明顯改善;且大劑量雙路通腦方組對(duì)神經(jīng)元損傷的改善程度優(yōu)于中、小劑量雙路通腦方組;大劑量雙路通腦方+AICAR組神經(jīng)元損傷較大劑量雙路通腦方組明顯加重,神經(jīng)元數(shù)量減少,壞死神經(jīng)元增多。見(jiàn)圖2。

A:假手術(shù)組;B:模型對(duì)照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.4大鼠神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組缺血半影區(qū)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)元凋亡率和自噬小體數(shù)量比較

2.5大鼠缺血半影區(qū)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬小體形成的影響 假手術(shù)組神經(jīng)元正常,具有完整的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng);模型對(duì)照組神經(jīng)元可以發(fā)現(xiàn)許多溶酶體和自噬體,細(xì)胞形態(tài)受到嚴(yán)重影響,神經(jīng)元空泡化,線粒體明顯腫脹,嵴部分?jǐn)嗔?與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組自噬小體數(shù)量顯著增加(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組自噬小體數(shù)量顯著減少(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組神經(jīng)元自噬小體數(shù)量顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表1。

2.6大鼠缺血半影區(qū)海馬CA1區(qū)LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的影響 與假手術(shù)組缺血半影區(qū)海馬CA1區(qū)LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)(0.031±0.004)比較,模型對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)(0.084±0.009)顯著升高(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)分別為(0.070±0.008),(0.057±0.006),(0.044±0.005),均顯著降低(均P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)為(0.075±0.008),顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

A:假手術(shù)組;B:模型對(duì)照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.7大鼠海馬組織LC3、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平顯著升高,p62蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平顯著降低,p62蛋白水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平顯著升高,p62蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4,表2。

表2 6組大鼠海馬組織LC3、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)比較

A:假手術(shù)組;B:模型對(duì)照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

2.8大鼠海馬組織AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組的p-AMPK/AMPK和p-ULK1(S317)/ULK1比值顯著升高,p-mTOR/mTOR和p-ULK1(S757)/ULK1比值顯著降低(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,小、中、大劑量雙路通腦方組p-AMPK/AMPK和p-ULK1(S317)/ULK1比值顯著降低,p-mTOR/mTOR和p-ULK1(S757)/ULK1比值顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性;與大劑量雙路通腦方組比較,大劑量雙路通腦方+AICAR組p-AMPK/AMPK和p-ULK1(S317)/ULK1比值顯著升高,p-mTOR/mTOR和p-ULK1(S757)/ULK1比值顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5,表3。

表3 6組大鼠海馬組織AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

A:假手術(shù)組;B:模型對(duì)照組;C:小劑量雙路通腦方組;D:中劑量雙路通腦方組;E:大劑量雙路通腦方組;F:大劑量雙路通腦方+AICAR組。

3 討論

在我國(guó),中藥已廣泛用于預(yù)防或治療腦缺血或IS及其并發(fā)癥,如補(bǔ)陽(yáng)還五湯[11]、安宮牛黃丸、銀杏葉等[14]。壯醫(yī)是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分,在IS中有其獨(dú)特的生理病理觀和治療原則。壯醫(yī)將大腦稱為“巧塢”,人的神智、思維和認(rèn)知行為均屬于“巧塢”的功能。壯醫(yī)認(rèn)為“三道兩路”(氣道、水道、谷道、龍路、火路)是人體內(nèi)部氣血化生和運(yùn)行的關(guān)鍵。IS的病因毒邪經(jīng)“三道兩路”侵入人體臟腑組織,加之外感毒邪,“三道兩路”運(yùn)行不暢,氣血運(yùn)行失常,臟腑失去濡養(yǎng),痰瘀阻滯,濕熱內(nèi)生,引發(fā)“巧塢崩”。因此,通調(diào)“三道兩路”提升臟腑功能是IS的重要治療原則[15-16]。雙路通腦方中扶芳藤、黃花倒水蓮和田七均是廣西特色壯藥,具有通火路、龍路、祛濕解毒、活血化瘀的功效。茯苓善滲泄水濕,使?jié)駸o(wú)處聚,痰無(wú)由生;蒼術(shù)能健運(yùn)脾胃、祛除寒濕;法半夏、陳皮有燥濕化痰、理氣健脾的作用。提示雙路通腦方具有祛除體內(nèi)毒邪,疏通龍路、火路,使“三道兩路”恢復(fù)平衡的作用。

研究證實(shí),雙路通腦方對(duì)IS療效確切[10]。在本研究中,雙路通腦方以劑量依賴性方式改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能,并減少腦梗死體積和神經(jīng)元凋亡。提示雙路通腦方對(duì)IS具有神經(jīng)保護(hù)作用,這與以往的研究結(jié)果一致。此外,雙路通腦方減少了海馬CA1區(qū)自噬小體的形成,抑制LC3-II/LC3-I比值的增加,并增加缺血半影區(qū)海馬中p62水平,下調(diào)了Beclin-1表達(dá);表明雙路通腦方的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制自噬有關(guān)。本研究結(jié)果也與之前的其他研究一致[8-9],這表明抑制自噬可改善再灌注24 h后的缺血性腦損傷。然而,SUN等[17]報(bào)道,自噬的誘導(dǎo)可防止再灌注24 h后的腦I/R損傷。適當(dāng)?shù)淖允蓪?duì)缺血性神經(jīng)組織具有保護(hù)作用,而過(guò)度的自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬在IS中的作用存在爭(zhēng)議,可能是由于不同的動(dòng)物品系、缺血模型和缺血時(shí)間以及評(píng)估自噬的治療時(shí)間窗的差異造成的。此外,WANG等[18]提出自噬對(duì)IS有益還是有害取決于自噬的程度和持續(xù)時(shí)間。本研究表明,自噬對(duì)IS有害,雙路通腦方預(yù)處理介導(dǎo)的自噬抑制可進(jìn)一步減少梗死體積并改善神經(jīng)功能缺損。因此,IS的潛在治療策略是優(yōu)化自噬水平,而雙路通腦方可能有助于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

AMPK/mTOR信號(hào)通路可以通過(guò)ULK1的協(xié)同磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)腦I/R后的自噬激活。AMPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mTOR的上游調(diào)節(jié)因子,AMPK促進(jìn)自噬,mTOR抑制自噬[19]。AMPK通過(guò)Ser317的磷酸化直接激活自噬起始激酶ULK1來(lái)促進(jìn)自噬。高mTOR活性通過(guò)磷酸化ULK1 Ser757并破壞ULK1和AMPK之間的相互作用來(lái)防止ULK1活化[20]?；罨腁MPK可以抑制mTOR激活以減少ULK1在Ser757上的磷酸化。本研究發(fā)現(xiàn),在MCAO術(shù)后,p-AMPK和p-ULK1 Ser317水平上調(diào),而p-mTOR和p-ULK1 Ser757水平下調(diào);這些結(jié)果與黃亞光等[8]研究結(jié)果一致。表明AMPK的活化抑制mTOR減少S757-ULK1磷酸化,然后磷酸化S317-ULK1,在腦I/R損傷期間誘導(dǎo)自噬。雙路通腦方顯著降低了p-AMPK和p-ULK1 Ser317的水平,同時(shí)增加了p-mTOR和p-ULK1 Ser757的水平。在給予AICAR激活A(yù)MPK后,自噬水平增加,雙路通腦方的神經(jīng)保護(hù)作用和對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用被明顯減弱。提示雙路通腦方可能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路抑制神經(jīng)元的過(guò)度自噬。

綜上所述,雙路通腦方可抑制腦I/R誘導(dǎo)的自噬和神經(jīng)元凋亡,其作用機(jī)制可能涉及抑制AMPK和ULK1在S317處的磷酸化,以及增強(qiáng)mTOR和ULK1在Ser757處的磷酸化。本研究以腦I/R誘導(dǎo)的自噬和神經(jīng)元凋亡為病理基礎(chǔ),在免疫組織學(xué)上對(duì)自噬和凋亡進(jìn)行了分析,以自噬為研究重點(diǎn),采用TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡來(lái)驗(yàn)證雙路通腦方調(diào)節(jié)自噬改善腦損傷的結(jié)果,今后將增加凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè),進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)元凋亡進(jìn)行驗(yàn)證。此外,在給予AICAR激活A(yù)MPK后,與單獨(dú)應(yīng)用大劑量雙路通腦方組相比,大鼠腦組織自噬水平增加,雙路通腦方的神經(jīng)保護(hù)作用和對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用被明顯減弱,提示雙路通腦方可能是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用。為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用量,降低實(shí)驗(yàn)成本,符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則,故未進(jìn)行模型對(duì)照組+AICAR組相關(guān)研究,在后續(xù)的研究中將繼續(xù)對(duì)小、中劑量雙路通腦方+AICAR組進(jìn)行研究,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否呈劑量依賴性,來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)尚不清楚雙路通腦方是否還調(diào)節(jié)其他途徑以及其在不同缺血時(shí)間中對(duì)自噬是否發(fā)揮相同作用,還待進(jìn)一步研究。