劉海濤,侯金鳳,寇晉萍,劉琦,齊麟（北京市藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

門冬氨酸鳥氨酸為L-鳥氨酸和L-門冬氨酸通過化學合成制備得到的穩(wěn)定的二肽化合物。該品能直接參與肝細胞代謝，并能激活肝臟解毒功能中的兩個關鍵酶，從而有效地改善肝功能，恢復機體能量平衡。主要用于治療因急慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎等所致的高血氨癥[1]。門冬氨酸鳥氨酸最早于20世紀70年代在德國用于臨床，并被美國FDA批準用于治療肝性腦病。目前常用的劑型有粉針劑、顆粒劑、注射液，其中顆粒劑適用于患者早期及日常治療，服用方便，安全有效[2]。

門冬氨酸鳥氨酸本身紫外吸收較弱，其含量通常采用柱前衍生HPLC法[3]測定，這種方法對于輔料較多的顆粒劑中有關物質的檢查不太適合，一方面因為衍生試劑干擾較大，另一方面是衍生后產物不穩(wěn)定，影響準確性。也有文獻采用HPLC法測定門冬氨酸鳥氨酸原料、注射劑有關物質的報道[4-5]，但顆粒劑有關物質的報道基本沒有。鑒于此，本文通過對門冬氨酸鳥氨酸基于合成路線的雜質譜分析，嘗試建立了使用氨基柱HPLC方法測定門冬氨酸鳥氨酸顆粒有關物質，明確了需要重點關注的非工藝雜質，新方法能夠保證主成分與雜質及輔料良好分離，雜質檢出限均小于供試品濃度的0.002%，故而具有靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點。具體報道如下。

1 儀器與試藥

儀器與試藥具體內容見表1。

2 方法與結果

2.1 雜質譜分析

2.1.1 工藝雜質分析 門冬氨酸鳥氨酸的合成路線見圖1。從門冬氨酸鳥氨酸的合成路線可以看出，起始原料富馬酸可能由于反應不充分而殘留在終產品中，因此將其定為工藝雜質。馬來酸為起始原料富馬酸的同分異構體，蘋果酸為L-天冬氨酸制備過程中可能產生的副產物，精氨酸為L-鳥氨酸制備過程中可能產生的副產物，MNA-III則作為最后一步中和反應的副產物，均定為工藝雜質。

圖1 門冬氨酸鳥氨酸合成路線圖

2.1.2 降解雜質分析 L-鳥氨酸分子結構中的5-位氨基在酸堿及高溫等條件下進攻羧酸發(fā)生分子內的關環(huán)反應得到MNA-I。具體產生機理見圖2。

圖2 MNA-I的降解機理圖

L-天冬氨酸分子結構中的氨基進攻另一分子結構中的4-位羧基發(fā)生分子間的縮合反應得到MNA-II。具體產生機理見圖3。

圖3 MNA-II的降解機理圖

由原料藥的合成工藝研究可知，馬來酸、蘋果酸、精氨酸、富馬酸均為門冬氨酸鳥氨酸合成工藝中的工藝雜質，因此在原料藥中進行研究和控制，不在制劑中進行控制。MNA-III雖然定為工藝雜質，但研究中發(fā)現(xiàn)高溫條件下該雜質有增大趨勢，因此將其在制劑中進行研究，但不作為特定雜質控制。由原料藥和制劑的雜質分析及質量研究可知，MNA-I和MNA-II為門冬氨酸鳥氨酸的降解雜質，且在制劑的影響因素試驗高溫條件中，MNA-I的含量有所增長，故不僅在原料藥中控制，還要在制劑中研究與控制。

2.2 有關物質檢查方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil XBP-NH2（250×4.6mm，5μm）；流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液[取磷酸二氫鉀2.72g，加水500ml溶解后，加入濃氨溶液5ml，用水稀釋至1000ml，混勻后用磷酸調節(jié)pH值至（5.60±0.05）]-乙腈（40∶60）；柱溫：30℃；流速：1.3ml/min；UV檢測器（檢測波長205nm）；進樣量：20μl。

2.2.2 溶液的制備及測定法 系統(tǒng)適用性溶液：取門冬氨酸鳥氨酸、MNA-Ⅰ、MNA-Ⅱ、MNA-Ⅲ對照品各適量，精密稱定，分別加流動相定量稀釋制成每1ml中約含門冬氨酸鳥氨酸4mg、MNA-Ⅰ12μg、MNA-Ⅱ6μg、MNA-Ⅲ 8μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

供試品溶液：取本品10袋，精密稱定，計算平均裝量。研細，取細粉適量（約相當于門冬氨酸鳥氨酸0.4g），精密稱定，置100ml量瓶中，加0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液40ml使其溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。測定法：精密量取對照溶液20μl，注入液相色譜儀，調節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的5%-10%；精密量取對照品混合溶液和供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至門冬氨酸保留時間的6倍。系統(tǒng)適用性及供試品溶液的典型色譜圖見圖4和圖5。

圖4 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖（1為MNA-Ⅲ峰，2為MNA-Ⅰ峰，3為門冬氨酸峰，4為鳥氨酸峰，5為MNA-Ⅱ峰）

圖5 供試品溶液色譜圖（1為輔料峰，2為未知雜質峰，3為MNA-Ⅰ峰，4為鳥氨酸峰，5為MNA-Ⅱ峰）

2.2.3 方法學考察 專屬性試驗：各峰間分離度大于1.5，符合要求。所用輔料在該測定條件下對雜質檢查無干擾。門冬氨酸鳥氨酸原料、國內產品和原研產品，在所設計的酸、堿、氧化和高溫降解條件下均不穩(wěn)定，MNA-I含量均有所增長，堿和氧化條件下降解較為劇烈，MNA-I含量增長較多，并產生較大（大于1%）的未知雜質。在光照破壞條件下穩(wěn)定，此色譜條件能將新增雜質與主峰完全分離；主峰峰純度合格；物料守恒。方法專屬性強。線性關系考察：取門冬氨酸鳥氨酸雜質MNA-I、MNA-II和MNAIII對照品各適量，用流動相溶解并稀釋制成每1ml含各組分約0.04mg的溶液，作為混合母液；精密量取混合母液1ml、8ml、2ml、3ml、4ml和8ml，分別置20ml、100ml、20ml、20ml、20ml、20ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別作為雜質線性1-6號溶液。取混合母液，直接作為雜質線性7號溶液。精密量取上述溶液各20μl，注入液相色譜儀，按初步擬定的有關物質方法測定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。門冬氨酸鳥氨酸在4.055-81.106μg/ml濃度范圍內線性關系良好，線性方程為y=2786x+565.2，r=0.9992；MNA-Ⅰ在2.099-41.982μg/ml濃度范圍內線性關系良好，線性方程為y=39280x-5615，r=0.9999；MNA-Ⅱ在1.864-37.285μg/ml濃度范圍內線性關系良好，線性方程為y=16708x-3300，r=0.9999；MNA-Ⅲ在1.989-39.788μg/ml濃度范圍內線性關系良好，線性方程為y=9189x-512.3，r=0.9999；當有關物質檢查時，門冬氨酸鳥氨酸對照溶液濃度為8μg/ml，MNA-I限度濃度為12μg/ml，MNA-II限度濃度為6μg/ml，MNA-Ⅲ限度濃度為8μg/ml，均滿足測定要求。

檢測限考察：取對照品溶液逐級稀釋，測定各組分檢測限，MNA-I檢測限為0.414ng，相當于供試品溶液濃度的0.00021%；MNA-Ⅱ檢測限為3.880ng，相當于供試品溶液濃度的0.00194%；MNA-Ⅲ檢測限為0.793ng，相當于供試品溶液濃度的0.00040%；門冬氨酸檢測限為20.118ng，相當于供試品溶液濃度的0.01006%；鳥氨酸檢測限為80.471ng，相當于供試品溶液濃度的0.04024%；各雜質檢測限信噪比均約為3，符合要求。

定量限考察：取對照品溶液逐級稀釋，測定各組分定量限，MNA-I定量限為2.068ng，相當于供試品溶液濃度的0.00103%；MNA-Ⅱ定量限為7.761ng，相當于供試品溶液濃度的0.00388%；MNA-Ⅲ定量限為1.587ng，相當于供試品溶液濃度的0.00079%；門冬氨酸定量限為40.236ng，相當于供試品溶液濃度的0.02012%；鳥氨酸定量限為160.942ng，相當于供試品溶液濃度的0.08047%；各雜質定量限信噪比均約為10，符合要求。

溶液穩(wěn)定性：對照品混合溶液進行溶液穩(wěn)定性考察，結果在25.2h內，各成分峰面積的RSD均小于2.0%，說明對照品混合溶液在25.2h內穩(wěn)定； 國產顆粒、國外市售Hepa-Merz?顆粒供試品溶液穩(wěn)定性考察，結果在25.2h內均未檢出新雜質，且各已有雜質含量均沒有明顯變化，說明供試品溶液在25.2h內穩(wěn)定，能滿足檢測要求。

準確度考察：各雜質高、中、低不同濃度回收率均在85%-115%之間；MNA-I回收率平均值為98.3 %，RSD為3.23%，小于5.0%；MNA-II回收率平均值為111.2%，RSD為2.00%，小于5.0%；MNA-III回收率平均值為98.7%，RSD為4.97%，小于5.0%；各雜質高、中、低不同濃度回收率均在85%-115%之間，說明方法準確度較高。

系統(tǒng)適用性：取系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)測定6次，各峰間的分離度均大于1.5，出峰順序依次為MNA-III、MNA-I、門冬氨酸、鳥氨酸與MNA-II。說明系統(tǒng)適用性符合要求。

耐用性考察：取系統(tǒng)適用性溶液，調整色譜條件后進樣測定，流速為1.1-1.5ml/min，柱溫為25℃-35℃，流動相pH為5.4-5.8，流動相緩沖液與乙腈的比例為43∶57-37∶63范圍內，各雜質間分離度符合要求，方法耐用；換用不同品牌色譜柱時，系統(tǒng)適用性溶液中MNA-Ⅰ與門冬氨酸峰無法分離，說明本方法對不同品牌色譜柱不耐用。色譜柱的品牌推薦Agela Venusil XBPNH2。為保證各組分峰保留時間的穩(wěn)定，將pH值嚴格控制在（5.60±0.05）范圍內。

3 討論

3.1 雜質譜分析中可以看到，MNA-Ⅰ（L-鳥氨酸內酰胺）為L-鳥氨酸分子內的關環(huán)反應生成，MNA-II為L-天冬氨酸分子間的縮合反應生成，分子內的關環(huán)反應在通常的酸堿環(huán)境或高溫條件下即可發(fā)生，分子間的縮合反應生成則需要較為苛刻的催化條件，因此雜質MNA-Ⅰ是門冬氨酸鳥氨酸原料和制劑中產生的主要已知雜質，應對其重點關注。

3.2 顆粒劑通常會使用較多的粘合劑和矯味劑，酸堿變化會導致雜質MNA-Ⅰ的生成，因此盡量避免使用可能會顯著改變pH值的輔料，選擇較為中性溫和的粘合劑和矯味劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、無水枸櫞酸、甘露醇、草莓香精等。

3.3 有關物質檢查法的選擇：目前可選擇的方法有中國藥典2020年版門冬氨酸鳥氨酸原料有關物質測定法以及門冬氨酸鳥氨酸原料藥生產商廠家標準中有關物質檢測方法，中國藥典2020年版門冬氨酸鳥氨酸原料標準方法中，各峰間分離度最小為6.11，而原料藥生產商廠家標準方法中，門冬氨酸與MNA-II分離度為1.05，不能有效分離。故參考中國藥典2020年版門冬氨酸鳥氨酸原料標準擬定本品的有關物質檢測方法。

3.4 色譜柱的選擇 在實驗過程中曾分別試驗過waters NH2（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo NH2（250mm×4.6mm，5μm）等各主要品牌的氨基色譜柱，但分離效能均沒有Agela Venusil XBP-NH2（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱效果好，方法學考察耐用性試驗中也可以看到，其他品牌色譜柱均不能使MNA-Ⅰ與門冬氨酸有效分離，因此本方法推薦使用Agela Venusil XBP-NH2色譜柱。

3.5 我國作為仿制藥大國，仿制藥質量參差不齊，對藥品的安全性和有效性評價造成了嚴重影響。為全面提高仿制藥的內在品質和制藥企業(yè)的綜合能力，同時確保人民用藥安全，并降低醫(yī)療費用的支出，開展仿制藥一致性評價工作十分必要。本研究建立的有關物質測定法同時考察了原料藥、國內顆粒和原研顆粒在強制降解條件下的雜質變化情況，并測定了國內顆粒和原研顆粒的樣品結果，為門冬氨酸鳥氨酸顆粒劑的一致性評價工作提供了重要的方法依據(jù)。