龔娟芬 劉吉丹 房夢園 蘇蒙 李偉光 何迎春

血管性癡呆（vascular dementia，VD）指因各種腦血管損傷導致學習、記憶、計算能力、定向力等認知功能嚴重下降的臨床綜合征[1]?，F(xiàn)用于改善VD 癥狀的藥物主要是多奈哌齊、加蘭他敏和美金剛等[2]，這些藥物療效有限，還可能引起嚴重的不良反應，如嘔吐、腹瀉、頭痛和高血壓等[3]。相比于單靶點化學藥物，中藥具有多組分、多靶點、不良反應少等特點，在VD 的治療中發(fā)揮了積極的作用[4-5]。健脾填精方由人參、天麻、白術、巴戟天、石菖蒲、黃連、菟絲子等中草藥組成，能改善輕度認知功能障礙患者的學習記憶功能，提高患者生活質(zhì)量[6]。動物研究發(fā)現(xiàn)，健脾填精方治療VD 的機制可能與減少大鼠腦組織氧化應激損傷，維持海馬的線粒體膜電位和ATP 水平，改善線粒體功能障礙等相關[7]。中藥復方成分復雜，定量蛋白質(zhì)組學技術是尋找疾病生物標志物和藥物治療靶點的新型手段[8]，能從分子層面分析中藥復方的作用機制。本研究通過蛋白質(zhì)組學技術篩選健脾填精方干預VD小鼠腦組織差異表達蛋白，并進一步對差異蛋白進行生物信息學分析，以期為健脾填精方的臨床應用及藥物藥理研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 ICR 雄性小鼠40 只（無特定病原體，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g），由上海市計劃生育研究所動物經(jīng)營部提供，動物合格證編號SCXK（滬）2018-0006，在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號SYXK（浙）2021-0012。所有小鼠提前適應性喂養(yǎng)1 周，實驗房室溫為（22±2）℃，濕度為（63±2）%，光照為明/暗=12 h/12 h，噪音＜55 dB，自由進食和飲水。所有程序均按照浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心指南進行，并由浙江中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，批準編號IACUC-20210906-12。

1.2 實驗藥物 自擬健脾填精方：人參9 g，天麻9 g，白術10 g，巴戟天6 g，石菖蒲6 g，黃連3 g，菟絲子12 g，由浙江中醫(yī)藥大學中藥教研室鑒定。前期研究發(fā)現(xiàn)健脾填精方最佳劑量為14.4 g/（kg·d），按照人與動物間體表面積折算的等效劑量比值換算成小鼠的治療劑量為20.160 g/（kg·d），口服劑量為10 mg/（kg·d）[9]。本研究中健脾填精方顆粒劑（含有草藥55g）用約27.3 ml 0.9%氯化鈉溶液溶解，得到終濃度為2.016 g/ml的健脾填精方溶液。

1.3 主要試劑 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒（批號：P0012）和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號：P0015F）購自上海碧云天生物技術有限公司；碘乙酰胺購自美國Sigma 公司，批號：I1149-5G；甲酸（批號：A117）購自德國Thermo Fisher Scientific 公司；乙腈（批號：1000304008）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；C18 分析柱（批號：WAT023590）購自美國Waters 公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、造模及給藥 40 只小鼠用隨機數(shù)字表法分為中藥組15 只，模型組15 只，假手術組10 只。所有小鼠均用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，中藥組和模型組小鼠采用短暫雙側頸總動脈阻斷法建立VD 模型[10]，經(jīng)頸正中切口顯露雙側頸總動脈，用絲線結扎雙側頸動脈10 min，然后松開10 min，重復3次，最后取下絲線縫合傷口。假手術組小鼠僅切開皮膚，不結扎雙側頸總動脈。術后連續(xù)3 d 予肌肉注射青霉素5 000 U/d 預防感染，用碘伏消毒傷口直至愈合。術后第7 天開始給藥，中藥組給予10 ml/（kg·d）健脾填精方溶液灌胃，模型組和假手術組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。3 組小鼠均給藥28 d。

1.4.2 Morris 水迷宮試驗 圓形逃生平臺位于第Ⅲ象限。3 組小鼠均訓練4 d，將小鼠放置在不同象限內(nèi)自由游泳90 s，如果90 s 內(nèi)沒有到達安全平臺，則引導至平臺停留10 s。將小鼠從第Ⅲ象限以外象限的水池壁放入水中，記錄到達逃生平臺的時間，即逃避潛伏期，共持續(xù)測試5 d。撤去圓形逃生平臺，將小鼠從第Ⅰ象限的水池壁放入水中，記錄1 min 內(nèi)跨越第Ⅲ象限平臺次數(shù)和在第Ⅲ象限停留的時間。

1.4.3 3 組小鼠腦組織蛋白提取及肽段制備 Morris水迷宮試驗結束后，將各組小鼠迅速斷頸處死，快速取腦。每組隨機選擇3 個腦組織樣本加入適量裂解液，超聲破碎，沸水浴10 min，14 000 r/min 離心15 min，留取上清液。采用BCA 法測定蛋白濃度[11]。取200 μg蛋白質(zhì)溶液根據(jù)過濾輔助樣品制備程序進行酶解，酶解后的肽段采用C18 柱脫鹽，肽段凍干后加入40 μl 0.1%甲酸溶液，進行肽段定量。

1.4.4 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析 采用NanoElute 系統(tǒng)進行色譜分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以100%的A液平衡，樣品由自動進樣器上樣到分析柱（IonOpticks，澳大利亞，25 cm×75 μm，C18 填料1.6 μm）分離，流速300 nl/min，持續(xù)90 min。進行液相梯度分離：0～75 min，B 液線性梯度為2%～22%；75～80 min，B 液線性梯度為22%～37%；80～85 min，B 液線性梯度為37%～80%；85～90 min，B 液為80%。經(jīng)色譜分離后的樣品用TimsTOF Pro 質(zhì)譜儀的平行累積連續(xù)碎裂技術模式進行質(zhì)譜分析。

1.4.5 蛋白質(zhì)鑒定和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 收集TimsTof pro高分辨率質(zhì)譜儀質(zhì)譜數(shù)據(jù)，肽段離子得分＞60 分表示結果可信。7～20 個氨基酸長度的肽段被認為符合胰蛋白酶解和高能碎裂的規(guī)律。大部分蛋白對應兩個以上肽段，表示蛋白質(zhì)定量結果可信。將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入Maxquant 軟件（版本號1.6.17.0），采用非標記定量（label free quantitation，LFQ）算法[12]對蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)進行計算，以差異倍數(shù)＞1.200 或＜0.833、P＜0.05的標準篩選差異蛋白。

1.4.6 蛋白質(zhì)生物信息學分析 通過http://www.bioinformatics.com.cn/在線軟件對差異表達蛋白進行聚類分析。運用http://geneontology.org/進行基因本體論（gene ontology，GO）分析。通過http://www.kegg.jp/進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。運用STRING 數(shù)據(jù)庫（https:// string-db.org/）構建蛋白互作網(wǎng)絡（protein-protein interaction，PPI）。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，采用Levene 法進行方差齊性檢驗，方差齊時組間比較采用單因素方差分析，方差不齊采用Mann-WhitneyU檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況及Morris 水迷宮試驗結果 手術時，中藥組和模型組各有3 只小鼠死亡；給藥期間中藥組和模型組各有2 只小鼠死亡。手術結束后，除假手術組，其他兩組小鼠均出現(xiàn)精神倦怠、納食減少和行動緩慢等現(xiàn)象。隨試驗進行，各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短；第2～5 天，與假手術組比較，模型組逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.01）。試驗第6 天，與假手術組相比，模型組和中藥組跨越平臺次數(shù)和停留在第Ⅲ象限的時間均顯著減少（均P＜0.01）；與模型組相比，中藥組1 min 內(nèi)跨越第Ⅲ象限平臺次數(shù)和在第Ⅲ象限停留的時間均顯著增加（均P＜0.01），見表1。

2.2 差異蛋白的鑒定結果 質(zhì)譜分析共得到蛋白質(zhì)二級譜圖數(shù)841 588 個，有效譜圖數(shù)393 081 個；鑒定到的肽段總數(shù)52 206 條，特異性肽段數(shù)50 097 條，鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)5 236個。蛋白質(zhì)肽段長度多為8～19 kD，處于合理范圍內(nèi)，約70%的肽段得分＞60分，大部分蛋白質(zhì)對應1個以上的特異性肽段，說明結果精確可信。

2.3 差異蛋白的表達情況 3 組共篩選出152 個差異蛋白，其中模型組與中藥組間65 個，包括表達上調(diào)蛋白39 個，表達下調(diào)蛋白26 個；模型組與假手術組間53個，包括表達上調(diào)蛋白32 個，表達下調(diào)蛋白21 個。聚類分析結果顯示，在模型組中上調(diào)或下調(diào)的蛋白，在假手術組、中藥組中表達相反，可見差異表達的蛋白可以有效地區(qū)分各組，見圖1（插頁）。

圖1 差異蛋白表達的聚類熱圖

2.4 GO 富集分析 模型組和中藥組間的差異蛋白主要涉及血漿脂蛋白的清除、細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、突觸膜粘附、神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、氮化合物代謝等生物過程；差異蛋白主要位于胞內(nèi)體、質(zhì)膜外側、突觸前膜等位置，與膽固醇結合、蛋白結合、離子結合、酶活性等分子功能相關，見圖2（插頁）。

圖2 GO 富集分析（A：生物過程分析；B：細胞組分分析；C：分子功能分析）

2.5 KEGG 富集分析和PPI 分析 KEGG 富集分析結果顯示，模型組和中藥組間的差異蛋白涉及維生素消化和吸收、丙酮酸代謝、谷氨酸突觸、代謝通路、神經(jīng)退行性變通路等信號通路，見圖3。將模型組與中藥組之間的差異蛋白導入STRING 數(shù)據(jù)庫構建PPI 網(wǎng)絡，結果顯示該網(wǎng)絡中共有55個節(jié)點，128條邊。主要差異蛋白質(zhì)有參與谷氨酸突觸信號通路的代謝性谷氨酸受體2（metabotropic glutamate receptor 2，Grm2），與氧化磷酸化相關的細胞色素c 氧化酶亞基7C（cytochrome c oxidase subunit 7C，Cox7C），調(diào)節(jié)細胞離子穩(wěn)態(tài)的蛋白偶聯(lián)鋅反轉運蛋白Slc30a1（proton-coupled zinc antiporter Slc30a1，Slc30a1）也在其中，見圖4。使用Cytoscape 3.9.1 軟件的cytoHubba 插件可篩選出關鍵蛋白，關鍵蛋白為差異表達基因集合中具有最強調(diào)控作用的基因，見圖5。

圖3 KEGG 通路富集結果（A：通路分類圖；B：KEGG 富集點線圖）

圖5 關鍵蛋白網(wǎng)絡圖

3 討論

VD 是一種復雜的腦部疾病，腦血管損傷導致腦灌注減少可能是VD 的潛在機制。研究認為，腦灌注減少時，氧氣和能量供應減少，直接導致線粒體功能障礙和離子失衡，之后神經(jīng)興奮性毒性、氧化應激等分子機制被激活[13]。Olloquequi 等[14]認為，興奮性谷氨酸受體過度激活引起神經(jīng)元功能障礙或死亡，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于興奮性毒性狀態(tài)，這可能與VD 的發(fā)病相關。差異蛋白Grm2 可降低由氧化應激介導的興奮性毒性，減少神經(jīng)元死亡，改善認知功能[15]。健脾填精方減輕興奮性毒性的作用機制可能與活性成分人參皂苷、白術內(nèi)酯Ⅲ有關。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷通過抑制星形膠質(zhì)細胞興奮性毒性而發(fā)揮保護神經(jīng)和增強認知的作用[16]。白術內(nèi)酯Ⅲ可通過抑制半胱天冬酶信號通路，減輕谷氨酸誘導的神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[17]。

缺氧條件下，線粒體功能障礙可引發(fā)能量代謝異常，活性氧與抗氧化劑之間的平衡被打破，自由基增多，引起氧化應激反應，導致神經(jīng)元細胞死亡，這可能是VD 發(fā)病的原因之一[18]。差異蛋白Cox7C 能夠促進ATP 合成，減少線粒體功能障礙的發(fā)生，減輕氧化應激反應[19]。健脾填精方減輕氧化應激的作用機制可能與活性成分白術內(nèi)酯、巴戟天低聚糖有關。白術內(nèi)酯可減少活性氧形成，減輕氧化損傷，增加記憶相關蛋白，如突觸素I 和蛋白激酶C 的表達，從而改善記憶能力[20]。Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天低聚糖可抑制癡呆模型大鼠海馬CA1 腦區(qū)、皮質(zhì)和前腦基底核神經(jīng)元細胞減少，增強抗氧化能力并防止自由基損傷，提高大鼠學習記憶能力。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥組小鼠腦組織中Grm2、Cox7C 表達上調(diào)，說明健脾填精方可能通過減輕神經(jīng)系統(tǒng)興奮性毒性、抗氧化應激和減輕線粒體功能障礙從而發(fā)揮改善VD 的作用。

動脈粥樣硬化可能是VD 發(fā)生的原因之一，鳥苷酸環(huán)化酶可溶性亞基α-3（guanylate cyclase soluble subunit alpha-3，Gucy1a3）能防止動脈粥樣硬化的發(fā)生[22-23]。Gucy1a3 編碼可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的α1 亞基，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶復合體是一氧化氮受體，可催化環(huán)狀鳥苷3'，5'-單磷酸酯（Guanosine-3'，5'-cyclic monophosphate，cGMP）的形成，cGMP 可調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、松弛血管平滑肌細胞和抑制血小板聚集等生理過程[24]。健脾填精方中的黃連素是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿，可改善動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷[25]。經(jīng)健脾填精方干預的小鼠腦組織中Gucy1a3 表達上調(diào)，而模型組小鼠腦組織中Gucy1a3 的表達無明顯變化，說明健脾填精方可能通過上調(diào)Gucy1a3 的表達，發(fā)揮防治VD 的作用。

腦缺血時，突觸活動增強引起鋅離子（Zn2+）釋放增加，細胞內(nèi)高水平的Zn2+可對神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生毒性，最終導致神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞快速死亡[26]。差異蛋白Slc30a1 參與了調(diào)節(jié)細胞離子穩(wěn)態(tài)的過程。Slc30a1 是Zn2+吸收和轉運的關鍵調(diào)控因子，其表達增多可降低神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)Zn2+水平，使其免受Zn2+中毒的影響，維持Zn2+穩(wěn)態(tài)，減少神經(jīng)細胞死亡[27]。天麻的主要生物活性成分天麻素可以抑制Zn2+誘導的細胞死亡，保護星形膠質(zhì)細胞免受Zn2+的毒性影響和氧化應激損傷[28]。經(jīng)健脾填精方治療的VD 小鼠腦組織Slc30a1 水平明顯增加，證實了健脾填精方可通過調(diào)節(jié)細胞離子穩(wěn)態(tài)，保護神經(jīng)元。

除人參皂苷、白術內(nèi)酯、巴戟天低聚糖類、黃連素、天麻素等活性成分外，健脾填精方中還可能存在其他活性成分，但是否對改善VD 有利還需進一步證實?？傊?，健脾填精方對小鼠腦組織蛋白的影響可能涉及Grm2、Cox7C、Gucy1a3、Slc30a1 等關鍵蛋白，通過減輕興奮性毒性、抗氧化應激、減輕線粒體功能障礙、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)細胞離子穩(wěn)態(tài)等途徑，起到改善VD 的作用。