范巍巍 曹萌 魏清筠

在中國(guó)，肝癌是高發(fā)性惡性腫瘤，手術(shù)切除是目前臨床治療的主要手段，但術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率高達(dá)40%～60%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)由多基因參與的、多步驟、多階段的由體內(nèi)外多因素相互作用的復(fù)雜過程，涉及編碼和非編碼基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的異常。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來研究較多的一類非編碼基因，異常表達(dá)的miRNA 可能在肝細(xì)胞癌變中發(fā)揮重要作用，與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后和治療等緊密相關(guān)[2-4]。Li 等[5]發(fā)現(xiàn)，miR-26a-5p 在腫瘤組織和細(xì)胞中均異常低表達(dá)，過表達(dá)miR-26a-5p 可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。Ji 等[6]發(fā)現(xiàn)，肝癌患者miR-26-5p 的表達(dá)水平與IL-6 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而IL-6 可通過多條信號(hào)通路直接或間接影響腫瘤進(jìn)程，提示miR-26a-5p 可能通過影響IL-6 相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展起調(diào)控作用。本研究檢測(cè)miR-26a-5p 和IL-6 在多種肝細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析過表達(dá)miR-26a-5p 對(duì)肝轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞SK-HEP-1 轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響，驗(yàn)證miR-26a-5p與IL-6 基因的靶向作用關(guān)系，探討其可能的分子機(jī)制，以期為肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移提供有價(jià)值的分子診斷標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng) 人肝細(xì)胞株LO2，人肝癌細(xì)胞株HepG2、BEL-7402、SMMC-7721，高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC97H，肝轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞株SK-HEP-1，均購自富衡生物科技（上海）有限公司。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃，含5%二氧化碳（CO2）的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，使用含10% FBS、100 U/ml 青霉素及100 U/ml 鏈霉素的高糖（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基。0.25%胰酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。所有實(shí)驗(yàn)均在江蘇省中醫(yī)藥研究院完成。

1.1.2 主要試劑 miR-26a-5p 模擬物和模擬物對(duì)照購自中國(guó)百奧邁科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為BH0930 和BIO82201。Transwell 小室（批號(hào)：2144016）購自美國(guó)Millipore 公司，Matrigel 基質(zhì)膠（批號(hào)：356237）購自美國(guó)Corning 公司。pMIR-REPORT ?miRNA 表達(dá)報(bào)告基因載體系統(tǒng)（批號(hào)：AM5795）購自美國(guó)ThermoFisher 公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：E1910）購自美國(guó)普洛麥格生物技術(shù)有限公司。Trizol 提取試劑（批號(hào)：15596018）購自美國(guó)ThermoFisher 公司。MiPure 細(xì)胞miRNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購自中國(guó)諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為RC201、R323-01、Q712-02。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)：P0010）購自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）抗體、磷酸化STAT3（phospho- STAT3，p-STAT3）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國(guó)CST 公司，批號(hào)分別為4904T、9145T、5741S、3195T、5174T。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（批號(hào)：20000626）購自Proteintech 公司。IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)：100802）購自美國(guó)R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 6 種細(xì)胞miR-26a-5p 表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）法。使用miRNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總miRNA，采用莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)SYBR Green qRT-PCR 試劑盒說明書方法檢測(cè)細(xì)胞miR-26a-5p 相對(duì)表達(dá)量，以U6 作為內(nèi)參。miR-26a-5p 引物序列：逆轉(zhuǎn)錄CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCCTATC，F(xiàn)-5'-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA-3'，R-5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 引物序列：F-5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R-5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.2 6 種細(xì)胞IL-6 mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SYBR Green qRT-PCR 試劑盒說明書方法檢測(cè)細(xì)胞中IL-6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。IL-6 mRNA引物序列：F-5'-GGCACTGGCAGAAAACAACC- 3'，R- 5'- GCAAGTCTCCTCATTGAATCC- 3'；GAPDH 引物序列：F-5'-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3'，R-5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以1.2.1 中miR-26a-5p 表達(dá)水平最高的細(xì)胞株作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)整密度至1.5～2.0×105/孔，接種于6 孔板中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞達(dá)到50%融合度時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含雙抗的DMEM 培養(yǎng)基。使用miR-26a-5p模擬物和模擬物對(duì)照分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為miR-26a-5p 模擬物組和模擬物對(duì)照組；以轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體組細(xì)胞為空白對(duì)照組，共3 組。轉(zhuǎn)染4～6 h 后，將培養(yǎng)基更換為含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-6 表達(dá)的檢測(cè) 采用ELISA 法。1.2.3 中各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，稀釋后加入酶標(biāo)板中。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書方法，測(cè)定450 nm 時(shí)的光密度，以空白顯色孔為對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)的結(jié)果，繪制“吸光值-濃度”曲線，計(jì)算3 組細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-6 質(zhì)量濃度。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性的檢測(cè) 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。通過工具網(wǎng)站TargetScan 預(yù)測(cè)分析miR-26a-5p 與IL-6 的堿基結(jié)合位點(diǎn)。將野生型（Wt）的IL-6 3'-非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）的序列擴(kuò)增到pMIR-Report 熒光素酶載體系統(tǒng)的下游位點(diǎn)，引物序列：F- 5'- CTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTA- 3'，R- 5'- AGCTTAAATGTTTCAAGTGGTACTTCTTAAAAATATAGAGC-T-3'，構(gòu)建熒光素報(bào)告基因質(zhì)粒。設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，將結(jié)合位點(diǎn)中種子序列TT突變?yōu)锳A，引物序列：F-5'-CTATATTTTTAAGAAGTACCACAAGAAACATTTA- 3'，R- 5'- AGCTTAAATGTTTCTTGTGGTACTTCTTAAAAATATAGAGCT- 3'，構(gòu)建靶點(diǎn)突變型（Mut）報(bào)告基因質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2.0×104/孔的密度接種于24 孔板中，實(shí)驗(yàn)分為6 組：miR-26a-5p 模擬物組、模擬物對(duì)照組、空白對(duì)照組、miR-26a-5p 模擬物+空載質(zhì)粒組、miR-26a-5p 模擬物+ Wt 質(zhì)粒組、miR-26a-5p 模擬物+ Mut 質(zhì)粒組。共轉(zhuǎn)染48 h 后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒方法裂解細(xì)胞，檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力的檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將1.2.3 中3 組細(xì)胞調(diào)整密度至2×105/ml 接種于6 孔板中，待細(xì)胞達(dá)到50%融合度時(shí)，用無菌槍頭在單層細(xì)胞上直線劃痕，PBS 清洗，分別于0 和48 h 時(shí)倒置顯微鏡觀察并拍照。重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，每次2 個(gè)復(fù)孔。對(duì)拍照視野中遷移過原劃線的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用Image J 軟件測(cè)量?jī)蓚?cè)細(xì)胞的間距。

1.2.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 采用Transwell 法。在24 孔Transwell（膜孔徑8 mm）的上室加入1 g/L 的基質(zhì)膠70 μl，37 ℃放置60 min 后形成基底膜結(jié)構(gòu)。取1.2.3 中3 組細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/ml，取200 μL 細(xì)胞懸液接種于上室，下室加入含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基500 μl，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h 后，棉簽?zāi)ㄈV膜上層細(xì)胞，甲醇固定。結(jié)晶紫染色15 min。重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，光鏡觀察拍照，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 轉(zhuǎn)染細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法。收集1.2.3各組細(xì)胞，裂解后，4 ℃12 000 r/min 離心15 min 收集總蛋白。根據(jù)BCA 試劑盒方法測(cè)定蛋白含量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉后，加入STAT3、p-STAT3、E-cadherin、Vimentin、GAPDH 等一抗，4 ℃孵育過夜；PBS 溶液洗膜3 次，加入HRP 二抗，室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法，滴加ECL 顯影液進(jìn)行熒光顯影，拍照保存。以鼠GAPDH 單抗作為內(nèi)參，使用Image J圖像處理軟件分析目的條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值。

1.2.9 EMT 相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用qRTPCR 法。收集1.2.3 各組細(xì)胞，參照1.2.2 方法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 法擴(kuò)增mRNA。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。E-cadherin 蛋白的編碼基因CDH1 引物序列：F-5'-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3'，R-5'-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3'；N-cadherin 蛋白的編碼基因CDH2 引物序列：F-5'-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3'，R-5'- GTAGGATCTCCGCCACTGATTC-3'；Snail 蛋白的編碼基因SNAI1 引物序列：F-5'-TGCCCTCAAGATGCACATCCGA-3'，R-5'-GGGACAGGAGAAGGGCTTCTC-3'；Slug 蛋白的編碼基因SNAI2引物序列：F-5'-ATCTGCGGCAAGGCGTTTTCCA-3'，R-5'-GAGCCCTCAGATTTGACCTGTC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 種細(xì)胞miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較 相比LO2，BEL-7402、SMMC-7721、MHCC97H和SK-HEP-1 細(xì)胞中miR-26a-5p相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05），其中SK-HEP-1 細(xì)胞中miR-26a-5p 相對(duì)表達(dá)量最低，見圖1A。相比LO2，BEL-7402、SMMC-7721 和SK-HEP-1 細(xì)胞中IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），其中SK-HEP-1 細(xì)胞的IL-6 相對(duì)表達(dá)量最高，見圖1B。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以SK-HEP-1作為研究對(duì)象。

圖1 6 組細(xì)胞miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較（A：miR-26a-5p；B：IL-6）

2.2 3 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-26a-5p 和IL-6 表達(dá)的比較與模擬物對(duì)照組比較，miR-26a-5p 模擬物組細(xì)胞中miR-26a-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），可用于后續(xù)功能試驗(yàn)分析；miR-26a-5p 模擬物組IL-6 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組和模擬物對(duì)照組miR-26a-5p、IL-6 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-26a-5p和IL-6表達(dá)的比較（A：miR-26a-5p相對(duì)表達(dá)量；B：IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量；C：IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量）

2.3 轉(zhuǎn)染miR-26a-5p 細(xì)胞熒光素酶活性的比較TargetScan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-6 mRNA 的3'-UTR 存在miR-26a-5p 高度保守的靶向結(jié)合位點(diǎn)，見圖3A。與模擬物對(duì)照組比較，miR-26a-5p 模擬物組IL-6 3'-UTR 熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（P＜0.05）；空白對(duì)照組和模擬物對(duì)照組熒光素酶相對(duì)活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與miR-26a-5p 模擬物+Mut 質(zhì)粒組比較，miR-26a-5p 模擬物+Wt 質(zhì)粒組IL-6 3'-UTR 熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（P＜0.05）；miR-26a-5p 模擬物+Mut 質(zhì)粒組和miR-26a-5p 模擬物+空載質(zhì)粒組比較，熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3B。說明miR-26a-5p 與靶基因IL-6 mRNA 3'-UTR 的結(jié)合作用是序列特異的。

圖3 miR-26a-5p 與IL-6 mRNA 3'-UTR 的靶向結(jié)合關(guān)系（A：Wt 和Mut IL-6 3'-UTR 與IL-6 mRNA 的潛在結(jié)合位點(diǎn)示意圖；B：6 組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性的比較）

2.4 3 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力的比較 相比空白對(duì)照組和模擬物對(duì)照組，miR-26a-5p 模擬物組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著降低（P＜0.01），細(xì)胞間劃痕的距離顯著增大（P＜0.01），見圖4。提示miR-26a-5p 抑制細(xì)胞遷移。2.5 3 組轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲能力的比較 與模擬物對(duì)照組比較，miR-26a-5p 模擬物組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少（P＜0.01）；空白對(duì)照組和模擬物對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖4 miR-26a-5p 對(duì)細(xì)胞遷移的影響（A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)48 h 后3 組細(xì)胞遷移情況，×40；B：3 組細(xì)胞遷移數(shù)量比較；C：3 組細(xì)胞間劃痕距離比較）

圖5 miR-26a-5p 對(duì)細(xì)胞侵襲的影響（A：Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3 組細(xì)胞的侵襲能力，×100；B：3 組細(xì)胞侵襲數(shù)比較）

2.6 3 組細(xì)胞STAT3 蛋白磷酸化水平和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與模擬物對(duì)照組相比，miR-26a-5p 模擬物組p-STAT3/STAT3 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），模擬物對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示STAT3 蛋白水平基本不變，但p-STAT3蛋白水平降低，見圖6A-B。與模擬物對(duì)照組相比，miR-26a-5p 模擬物組E-cadherin 表達(dá)水平顯著增加，Vimentin 表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6C-D。

圖6 miR-26a-5p 對(duì)細(xì)胞STAT3 蛋白磷酸化及EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（A：3 組細(xì)胞STAT3 和p-STAT3 蛋白電泳圖；B：3 組細(xì)胞STAT3 和p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較；C：3 組細(xì)胞E-cadherin 和Vimentin 蛋白電泳圖；D：3 組細(xì)胞E-cadherin 和Vimentin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較）

2.7 3 組細(xì)胞EMT 相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的比較 與模擬物對(duì)照組相比，miR-26a-5p 模擬物組細(xì)胞中CDH1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，CDH2、SNAI1、SNAI2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖7。

圖7 3 組細(xì)胞EMT 相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的比較

3 討論

miR-26a-5p 全長(zhǎng)22 nt，其表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤演進(jìn)過程有關(guān)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織的miR-26a-5p 表達(dá)顯著低于癌旁肝組織，且低表達(dá)的患者預(yù)后較差，總生存率低[6]。miR-26a-5p 在肝癌組織和細(xì)胞中均異常低表達(dá)，過表達(dá)miR-26a-5p 可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[7-10]。miR-26a-5p 的下調(diào)與肝癌患者腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良顯著相關(guān)。Yang 等[11]發(fā)現(xiàn)，肝癌患者miR-26a-5p 表達(dá)水平與IL-6 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；聯(lián)合檢測(cè)miR-26a-5p 和IL-6 可作為判斷總生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。TargetScan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-6 mRNA 的3'-UTR 是高度保守的miR-26a-5p 的靶向區(qū)。推測(cè)miR-26a-5p 可能通過參與IL-6 相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展起調(diào)控作用[12-13]。

Trohatou 等[9]在體外培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞時(shí)加入IL-6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原癌基因（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc）激活，miR-26a-5p 的表達(dá)被抑制。與錢建升等[14]和Ma 等[15]發(fā)現(xiàn)的過表達(dá)miR-26a-5p 可抑制HepG2 和SMMC-7721 的增殖和遷移的結(jié)果一致。但要注意的是，不同肝癌細(xì)胞中miR-26a-5p 和IL-6 的表達(dá)水平不同[16]。本研究檢測(cè)并比較了miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 在正常人肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2 中miR-26a-5p高表達(dá)，IL-6 mRNA 幾乎不表達(dá)，而SK-HEP-1 剛好相反。使用化學(xué)合成miR-26a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染SK-HEP-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)miR-26a-5p 相對(duì)表達(dá)量顯著升高，IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低，IL-6 蛋白相對(duì)表達(dá)量也相應(yīng)降低。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-26a-5p 與IL-6 mRNA 3'-UTR 存在靶向關(guān)系，且兩者結(jié)合存在序列特異性。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，過表達(dá)miR-26a-5p 能顯著抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲。

IL-6 是腫瘤微環(huán)境中一種含量豐富的多能性細(xì)胞因子，通過Janus 激酶（Janus-activated kinase，JAK）/STAT 和NF-κB 等信號(hào)通路對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生直接或間接作用[17-20]。IL-6 信號(hào)激活會(huì)引起JAK 磷酸化，并誘導(dǎo)下游關(guān)鍵信號(hào)STAT3 磷酸化，活化的STAT3形成二聚體轉(zhuǎn)移入核，激活調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)IL-6/STAT3 信號(hào)異常激活[22-23]。IL-6/STAT3 信號(hào)不僅對(duì)原發(fā)性肝癌有影響，還會(huì)通過形成促轉(zhuǎn)移生態(tài)位造成腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致繼發(fā)性肝癌[24]。故STAT3 被認(rèn)為是介導(dǎo)IL-6 功能的最主要轉(zhuǎn)錄因子。EMT 是上皮細(xì)胞去分化轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型的生物學(xué)過程，被普遍認(rèn)為參與了肝癌的早期轉(zhuǎn)移進(jìn)程[25-26]。EMT 發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物Vimentin 表達(dá)增加[27]。Zhang 等[28]在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 和MHCC97H 中過表達(dá)STAT3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin 表達(dá)顯著下調(diào)，Vimentin 表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)通路在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[29-30]。

本研究在高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞SK-HEP-1 中過表達(dá)miR-26a-5p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲被有效抑制，其可能機(jī)制是通過靶向抑制IL-6 mRNA，下調(diào)STAT3 磷酸化，升高上皮標(biāo)志E-cadherin 表達(dá)和降低間質(zhì)標(biāo)志Vimentin 表達(dá)。即過表達(dá)miR-26a-5p 通過IL-6/STAT3 軸抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，可能是治療肝癌轉(zhuǎn)移的潛在策略。