焦會(huì)杰

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是嚴(yán)重危害人類健康的口腔疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1，2]。全球范圍內(nèi)OSCC 占所有新發(fā)癌癥病例的4%～7%[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，口腔鱗癌占口腔癌的90%以上[4]，加強(qiáng)對(duì)口腔鱗癌的研究在我國(guó)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。臨床上對(duì)于OSCC 的治療以手術(shù)為主輔以放化療的綜合治療，近年來OSCC的治療取得了很多的創(chuàng)新和改革，但患者的5 年生存率仍不超過60%[5]。OSCC 細(xì)胞比一般腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此研究藥物對(duì)于OSCC 的治療和預(yù)防具有重要意義。目前大量實(shí)驗(yàn)研究表明：OSCC的發(fā)生涉及多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜過程，由于大量基因表達(dá)的異常，致使分子代謝異常及細(xì)胞正常生理過程發(fā)生改變，轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)信號(hào)受阻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、免疫調(diào)節(jié)紊亂及細(xì)胞增殖等異常[6～8]。

雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特異性抑制劑,多樣性的生物活性，具有抗腫瘤、免疫抑制、抗真菌、保護(hù)神經(jīng)及抗老化等眾多作用[9，10]。研究證實(shí)mTOR 的靶蛋白參與細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過程，mTOR 信號(hào)通路則在細(xì)胞分化、增殖、存活和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。雷帕霉素通過抑制mTOR 與下游靶蛋白之間的相互作用，而呈現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞的作用[11]。隨著相關(guān)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展過程中地位顯著[12，13]。mTOR 作為平衡細(xì)胞生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子，在維持細(xì)胞生理狀態(tài)和應(yīng)對(duì)外部環(huán)境壓力的過程中起著至關(guān)重要的作用，mTOR 的抑制劑可以通過mTOR 相關(guān)信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮調(diào)控作用[14～17]。目前，雷帕霉素臨床上主要用作免疫抑制劑及抗腫瘤藥物。它多樣性的生物活性極大激發(fā)了科研工作者對(duì)其作用機(jī)制的研究興趣。因此本實(shí)驗(yàn)探討雷帕霉素對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞 SCC-4 增殖的抑制作用并探討其作用機(jī)制，為雷帕霉素防治口腔鱗癌提供臨床前研究依據(jù)。

材料與方法

1.材料與儀器

口腔鱗癌細(xì)胞株SCC-4，購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司；雷帕霉素，購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司；兔抗人P-S6K1單克隆抗體，購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；兔抗人p-AKT 單克隆抗體、兔抗人p-STAT3 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG，均購(gòu)自泊灣生物技術(shù)有限公司；B7 同系物（B7-H1)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，購(gòu)自武漢基因美生物技術(shù)股份有限公司。PM-10A 熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司、5414D 離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)EPPENDORF 公司、SUAAISETIV 酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利TECAV 公司、AX-80 多功能顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司、IQLAS400 化學(xué)發(fā)光成像分析儀等均購(gòu)自美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)公司。

2.方法

（1）MTT 法測(cè)定雷帕霉素對(duì)SCC-4 增殖作用的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCC-4 細(xì)胞，先用胰酶消化，再制成SCC-4 的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×104/mL，按照200 μL/孔接種于96 孔板中。實(shí)驗(yàn)分為空白組（無SCC-4，僅DMEM 培養(yǎng)基）、對(duì)照組（0 μmol/L 雷帕霉素）及不同濃度（20、40、80 μmol/L）的雷帕霉素給藥組,每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。SCC-4 細(xì)胞與藥物作用24 h 后,加入MTT 溶液（5 mg/ml）20 μL,繼續(xù)孵育4 h,棄掉培養(yǎng)基。每孔加入DMSO 150 μL，振蕩器振蕩10 min 溶解甲結(jié)晶。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇570 nm 波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞的抑制率,公式為：抑制率（%）＝1-（處理組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）/（對(duì)照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）×100%。

（2）Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組使用劑量為80 mol/L 雷帕霉素干預(yù)SCC-4 細(xì)胞株24 h，空白對(duì)照組SCC-4 細(xì)胞株在相同環(huán)境下未作干預(yù)24 h 后，分別收集細(xì)胞、提取細(xì)胞總蛋白。按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。利用蛋白印跡（Weastern Blot）技術(shù)，以細(xì)胞漿中的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 為抗原，分別以兔抗人p-S6K1 單克隆抗體、兔抗人p-AKT 單克隆抗體、兔抗人p-STAT3 單克隆抗體作為第一抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 為第二抗體，內(nèi)參基因?yàn)楣芗一騁APDH。分別取SCC-4 細(xì)胞蛋白樣品40 μg，經(jīng)過Tris-HCl 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜（0.45 μm）上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，將兔抗人p-S6K1 單克隆抗體、兔抗人p-AKT 單克隆抗體、兔抗人p-STAT3 單克隆抗體稀釋，比例為1:1000，兔抗人GAPDH 單克隆抗體稀釋，比例為1:3000。混合充分放入密封袋中。將經(jīng)過漂洗的PVDF 膜分別放入對(duì)應(yīng)的一抗中，4℃過夜。TBST 漂洗5 次，5 分鐘/次。用TBST 稀釋辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，比例為1:2500?；旌铣浞址湃朊芊獯校ㄗⅲ核姆N蛋白用同一種二抗）。將經(jīng)過漂洗的PVDF 膜置入密封袋中，室溫，繼續(xù)孵育1 h。用TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 顯色后，以管家基因GAPDH 作為內(nèi)參基因，利用Image Quant LAS4000 化學(xué)發(fā)光成像分析儀曝光PVDF 膜上條帶圖像并儲(chǔ)存。用Quantity One 圖像分析軟件記錄內(nèi)參條帶與目的條帶灰度值，并計(jì)算細(xì)胞SCC-4 中p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 的相對(duì)蛋白表達(dá)量。

（3）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)共刺激分子（B7-H1）的變化情況：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCC-4細(xì)胞,先用胰酶消化，再制成細(xì)胞數(shù)為5×105/mL，并以1 mL/孔接種于6 孔板。當(dāng)細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)至70%，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，8000 r/min 離心5 min。離心沉淀之后即刻檢測(cè)，小試管準(zhǔn)備7 只，按照說明書指示稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后各管濃度依次為：1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.25 pg/ml，15.63 pg/ml。分別設(shè)空白孔（空白孔不加酶標(biāo)試劑、樣品及生物素標(biāo)記的抗B7-H1 抗體）、待測(cè)樣品孔（每個(gè)樣本設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔）、標(biāo)準(zhǔn)品孔。每孔加入300 μl 1×洗液靜置浸泡30 s。棄掉洗液，在吸水紙上將微孔板拍干。每孔加入50 μl 1×檢測(cè)緩沖液，在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品50 μl，標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μl 倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，然后每孔再加稀釋后生物素標(biāo)記的抗B7-H1 抗體50 μl。用封板膜封板后，300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育2.5 h。棄掉液體并甩干，并每孔洗滌液添加300 μl，靜置30 s后棄掉并在吸水紙上拍干，此步驟重復(fù)6 次。每孔酶標(biāo)試劑添加100 μl，空白孔除外。使用新的封板模封板，300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育1 h。洗滌，棄掉洗液，在吸水紙上將微孔板拍干。每孔顯色底物TMB 添加100 μl,震蕩混勻，并在37 ℃避光環(huán)境中顯色15 min。每孔終止液加入100 μl 終止反應(yīng)?？瞻卓诪榱泓c(diǎn)，以波長(zhǎng)為450 nm 依次測(cè)量各孔OD值（吸光度）。為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，測(cè)定步驟應(yīng)在加入終止液后30 min 以內(nèi)進(jìn)行。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)為OD 值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。將樣品的OD 值代入方程式，就能算出每個(gè)樣品的實(shí)際濃度。使用80 μmol/L的mTOR 抑制劑雷帕霉素干預(yù)SCC-4 細(xì)胞株，采用ELISA 檢測(cè)干預(yù)24 h 后其下游共刺激分子（B7-H1）的變化情況。

3.結(jié)果分析和相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.MTT 結(jié)果顯示雷帕霉素可以顯著抑制口腔鱗癌細(xì)胞SCC-4 的增殖，且呈劑量依賴性。

不同濃度雷帕霉素對(duì)SCC-4 增殖的影響（結(jié)果如圖1 所示），隨著雷帕霉素給藥濃度增大，SCC-4細(xì)胞增殖的抑制率依次升高。當(dāng)雷帕霉素作用24 h，濃度為20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 時(shí)，SCC-4 細(xì)胞抑制率分別為8.2%、17.8%、36.7%，表明高劑量（≥80 μmol）雷帕霉素對(duì)SCC-4 細(xì)胞具有明顯的抑制作用，因此選擇80 μmol/L 對(duì)細(xì)胞抑制率較為明顯的劑量作為雷帕霉素的給藥劑量進(jìn)行下一步的研究。

圖1 不同濃度雷帕霉素對(duì)口腔鱗癌SCC-4 細(xì)胞增殖的影響

2.雷帕霉素對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預(yù)后檢測(cè)p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 等蛋白的表達(dá)情況。Western Blot檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比，雷帕霉素給藥組的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 等蛋白的表達(dá)均下降（結(jié)果如圖2所示），其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（結(jié)果如表1所示）。表明雷帕霉素能夠抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 的活化從而對(duì)SCC-4 細(xì)胞增殖具有抑制作用。

表1 WB 檢測(cè)80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預(yù)前后口腔鱗癌SCC-4 細(xì)胞中的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖2 WB 檢測(cè)80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預(yù)前后口腔鱗癌SCC-4細(xì)胞中p-AKT、p-STAT3 及p-S6K1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量,*號(hào)表示其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

3.雷帕霉素對(duì)細(xì)胞共刺激分子的影響

80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預(yù)后檢測(cè)共刺激分子（B7-H1)的濃度變化情況。ELISA 結(jié)果顯示使用80 μmol/L 的雷帕霉素給藥后，SCC-4 細(xì)胞株共刺激分子（B7-H1) 濃度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（結(jié)果如圖3、表2 所示）；表明雷帕霉素能夠降低PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路下游相關(guān)共刺激分子（B7-H1)的濃度，從而抑制鱗癌細(xì)胞增殖。

表2 80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預(yù)前后口腔鱗癌SCC-4 細(xì)胞中B7-H1 濃度

圖3 80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預(yù)前后口腔鱗癌SCC-4 細(xì)胞中B7-H1 濃度的直方圖，*號(hào)表示其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

討論

口腔鱗癌是嚴(yán)重危害人類健康的口腔疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[18～20]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)OSCC 的發(fā)病率明顯高于其他國(guó)家[21，22]。因此，加強(qiáng)OSCC 的研究具有重要的醫(yī)學(xué)意義。盡管手術(shù)和輔助治療方面取得了一定的進(jìn)展，但OSCC 患者的預(yù)后仍很差，主要原因是診斷晚、生存率低、局部復(fù)發(fā)和預(yù)后不良。因此，迫切需要探索口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，完善口腔鱗癌的治療和管理策略。本研究以口腔鱗癌SCC-4 為研究對(duì)象,主要探究雷帕霉素對(duì)鱗癌細(xì)胞的影響和作用機(jī)制，為雷帕霉素防治口腔鱗癌提供臨床前研究依據(jù)。

雷帕霉素（mTOR）抑制劑的機(jī)制靶點(diǎn)是來自吸水鏈霉菌的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可阻止T 淋巴細(xì)胞活化和B 細(xì)胞分化,具有抑制腫瘤、抑制機(jī)體免疫、抗真菌、保護(hù)神經(jīng)及抗老化等眾多作用[23，24]。由于mTOR 調(diào)控許多下游通路，mTOR 抑制劑可以影響這些通路來控制各種疾病。其中PI3K/AKT/mTOR通路就是細(xì)胞內(nèi)至關(guān)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖和凋亡等過程中扮演著極重要的生物學(xué)角色[25]且對(duì)多種腫瘤具有抑制作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是該通路最重要的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，STAT3 蛋白是決定腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)向著腫瘤形成還是抑制方向發(fā)展的關(guān)鍵因素[26]，STAT3 參與了腫瘤細(xì)胞和機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用，活化的STAT3 能降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷功能，從而為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供便利條件[26]。本實(shí)驗(yàn)將80 μmol/L 雷帕霉素作用于口腔鱗癌細(xì)胞24 h,抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)該調(diào)節(jié)因子的磷酸化水平較對(duì)照組明顯降低。

AKT 是PI3K/AKT 信號(hào)通路的中心調(diào)節(jié)效應(yīng)分子。利用Weastern Blot 檢測(cè)雷帕霉素作用于SCC-4后,發(fā)現(xiàn)AKT 蛋白磷酸化水平降低，表明雷帕霉素作用后，PI3K/AKT 信號(hào)通路在一定程度上被抑制[27]。

B7-H1 可在腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織樹突狀細(xì)胞上表達(dá),并在誘導(dǎo)特異性T 細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。雖然人的正常組織中表達(dá)B7-H1 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但卻很難檢測(cè)到B7-H1 蛋白的表達(dá)。相反在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中可以檢測(cè)到B7-H1蛋白的高表達(dá)，提示可能在腫瘤發(fā)生的某一階段B7-H1 的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程明顯增加[28]。Parsa 等研究表明神經(jīng)膠質(zhì)瘤中抑癌基因的缺失調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)下游的核糖體蛋白S6 激酶1（S6 kinase 1，S6K1）通路實(shí)現(xiàn)對(duì)B7-H1 基因翻譯水平的調(diào)控,導(dǎo)致B7-H1 蛋白表達(dá)增加,從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[29]。利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)雷帕霉素作用于口腔鱗癌后，發(fā)現(xiàn)B7-H1 的表達(dá)降低，表明雷帕霉素在一定程度上抑制了鱗癌細(xì)胞的免疫逃逸。

綜上所述，本研究的結(jié)果證實(shí)雷帕霉素通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，抑制口腔鱗癌細(xì)胞SCC-4 增殖，并表現(xiàn)出濃度依賴性的抗腫瘤作用。雷帕霉素引起共刺激分子（B7-H1)的表達(dá)降低，進(jìn)而降低鱗癌逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，從而抑制鱗癌細(xì)胞增殖。此外，下調(diào)信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR 相關(guān)蛋白的表達(dá)可能是雷帕霉素抑制口腔鱗癌細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制之一,雷帕霉素可下調(diào)凋亡相關(guān)p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 蛋白磷酸化水平，這可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明雷帕霉素對(duì)于防治口腔鱗癌具有一定應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。為口腔鱗癌防治提供新的理論基礎(chǔ)，為雷帕霉素在口腔鱗癌及其他惡性腫瘤的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。