馮鈺皓 齊 霞 沈益名 楊冬茹

牙周炎是一種導致牙齒支持組織（牙骨質、牙周膜和牙槽骨）進行性破壞的慢性炎癥。從全球的狀況來看，大約有11%的世界人口可能患有嚴重的牙周炎，影響到7.43 億人[1]。牙周炎的主要臨床表現為牙齦出血，臨床附著喪失（CAL），牙周袋形成，牙槽骨吸收[2]。它以牙菌斑為始動因子，由宿主免疫炎癥反應、遺傳和環(huán)境等多種因素造成。然而，牙周炎的病理機制尚未完全明確。近年來，諸多研究證實：高遷移率族蛋白B1（high mobility group B1,HMGB1）在牙周炎病理過程中同時具有促進炎癥及組織再生的雙重作用,并參與伴吸煙、糖尿病牙周炎的發(fā)生發(fā)展[3，4]。HMGB1 作為真核細胞中高度保守的、廣泛表達的非組蛋白核蛋白，在炎癥及感染刺激下可由壞死、受損細胞被動釋放或免疫細胞主動分泌至胞外。HMGB1 作用于靶細胞表面Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）和晚期糖基化終末產物受體（receptor of advanced glycation end-product,RAGE），釋放損傷信號，參與炎癥和免疫反應，還可刺激細胞增殖及分化，啟動組織修復及再生[5～7]。HMGB1 的復雜生物學功能與其分子結構與定位、氧化還原狀態(tài)、分泌途徑、受體等相關。本文就HMGB1 在牙周炎作用的最新研究進展做一綜述。

一、HMGB1 的生物學特性

1.HMGB1 的結構：HMGB1 含有兩個以三個α螺旋和兩個環(huán)以“L”形排列的近端同源DNA 結合結構域，稱為A-box（9-79aa）和B-box（95-163aa），一個帶有重復的谷氨酸和天冬氨酸的C-末端酸性尾（186-215aa），以及一個短但具有重要功能的N末端結構域[8]。B-box 具有促炎活性，而A-box 為HMGB1 拮抗劑，能競爭性與B-box 結合，發(fā)揮抗炎修復作用，與C-末端酸尾融合后，A-box 的抗炎活性進一步增強[9]。細胞核中，HMGB1 參與核小體及染色體穩(wěn)定與維持、基因轉錄及損傷修復、端粒酶的功能及活性。HMGB1 在細胞核中的穩(wěn)定定位是與兩個核定位信號（nuclear localization signals，NLSs）有關：NLS1（28-44aa）和NLS2（179-185aa）。NES 和NLSs 的表觀遺傳修飾介導了HMGB1 亞細胞位置及功能改變[5]。

2.HMGB1 的胞質轉運：HMGB1 的胞質轉運和功能與翻譯后表觀遺傳修飾密切相關，其中最重要的是可逆性乙?；揎?。HMGB1 對DNA 的親和力取決于NLS1 及NLS2 的乙酰化程度。缺氧、缺血、細胞因子、感染等氧化應激可誘導NLSs 賴氨酸殘基突變?yōu)楣劝滨０?，促進HMGB1 的核胞質轉運和分泌[10]。此外，Lys42 甲基化修飾可改變HMGB1 蛋白構象，降低其DNA 結合活性[11]；C-末端酸性尾的ADP核糖化促進HMGB1 的分泌[12]；發(fā)生于N37、N134、N135N-糖基化修飾，減弱HMGB1 與DNA 的結合，促進HMGB1 的釋放[13]。目前普遍認為，HMGB1 的氧化還原修飾與其炎癥促進或者組織修復功能密切相關。HMGB1 的第23、45 和106 位半胱氨酸對氧化還原敏感，可產生三種異構體：完全還原型HMGB1，二硫化型HMGB1 和磺酰型HMGB1。完全還原HMGB1 在C23 和C45 之間形成二硫化鍵C23-S-S-C45，被氧化為二硫化型HMGB1，位于具有促炎活性B-box 的硫醇C106 通過TLR4/髓系分化因子2（myeloid differentiation factor-2，MD-2）復合體及RAGE 誘導促炎細胞因子的產生，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，從而發(fā)揮促炎作用[6，14，15]。

目前，不同氧化還原狀態(tài)HMGB1 在體內的分布尚不完全明確。生理情況下，完全還原型HMGB1存在于細胞核中，再生肌纖維細胞核中高表達完全還原型HMGB1[16]。然而，HMGB1 氧化可發(fā)生在小鼠骨髓來源巨噬細胞、小鼠胚胎成纖維細胞和HEK293 細胞核中，由細胞中高表達的抗氧化酶家族過氧化物還原蛋白（peroxiredoxins，Prxs）介導形成二硫鍵，是HMGB1 核質易位和分泌所必需的[17]。Michele 等也證實健康人白細胞裂解液中檢測出高表達二硫化型HMGB1[16]。

3.HMGB1 的釋放：由于缺乏前導信號序列，HMGB1 不能通過經典的內質網-高爾基體途徑分泌。感染或炎癥狀態(tài)下，HMGB1 可由壞死細胞、靶細胞程序性、促炎性的細胞凋亡、細胞焦亡釋放[8]，或進入細胞質的HMGB1 被包裝到細胞內囊泡，如溶酶體或自噬體中，囊泡與細胞質膜融合后通過胞吐作用主動釋放。此外，HMGB1 還可以外泌體的形式釋放。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）結合肝細胞表面TLR4，導致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11（cysteinyl aspartate specific proteinase-11,caspase-11）的表達增加，并裂解焦孔素（gasdermin D，GSDMD），引起內質網內Ca 離子流增加，激活磷酸化鈣調素激酶B 使HMGB1 以外泌體的形式釋放[18]。胞外HMGB1 可與多種細胞外受體結合，例如RAGE、TLR4、α-突觸核蛋白絲等，目前證據比較充分的受體為TLR4 及RAGE。HMGB1 通過特定結構域與受體相互作用：TLR4 結合位點位于HMGB1 序列89-108aa，RAGE 結合位點位于23-50aa 及150-183aa[19，20]（圖1）。

圖1 HMGB1 的分泌途徑

二、HMGB1 在牙周炎中的作用

1.HMGB1 對慢性牙周炎致病的作用：致病菌及其代謝產物引起過度的宿主免疫炎癥反應是造成慢性牙周炎的主要原因。在牙周微環(huán)境中，HMGB1 表現為雙重作用：加重炎癥反應、促進組織修復。

多項臨床研究證實：慢性牙周炎患者齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）及血清中HMGB1高表達，且牙周基礎治療后HMGB1 表達降低，HMGB1 水平與菌斑指數、出血指數、牙周袋深度、附著喪失正相關[21]。此外，實驗性牙周炎動物牙周組織免疫組化分析發(fā)現：HMGB1 在牙齦、牙周膜、根分叉區(qū)及下頜骨中表達均顯著升高。慢性牙周炎患者牙齦組織中HMGB1 主要表達在溝內上皮基底層、固有層炎性浸潤細胞及成纖維細胞中，牙槽骨中成骨細胞表達多于破骨細胞，在細胞質中表達均顯著高于細胞核[16]。此外，TLR2、TLR4、RAGE 在慢性牙周炎患者牙齦組織表達顯著高于健康對照組[17]。

牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）是慢性牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢菌，其毒力因子參與逃避宿主免疫防御機制，破壞牙周組織。其中，Pg-LPS 是TLR4 及RAGE 的有效配體，Pg 脂蛋白可作為TLR2 配體，均可激活NF-κB 通路，釋放HMGB1、TNF-α、IL-1β 等促炎因子[22]。牙齦卟啉單胞菌浸潤的結扎線誘導小鼠實驗性牙周炎模型，免疫熒光分析發(fā)現，牙齦上皮細胞中HMGB1從細胞核移位至細胞外，促進IL-1β 和C-X-C 基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）表達、中性粒細胞遷移和牙槽骨吸收，全身給藥抗HMGB1 抗體的可顯著抑制HMGB1 的易位，抑制牙周炎癥[4]。

2.HMGB1 對糖尿病牙周炎致病的作用：糖尿病是牙周炎的系統性危險因素，糖尿病患者牙周炎發(fā)病率是非糖尿病人的2～3 倍，表現為更嚴重的炎癥反應，且依靠局部治療難以控制的牙周組織破壞。糖尿病牙周炎的發(fā)病機制尚不明確。

高血糖促進牙周組織中HMGB1、RAGE 表達增加[23]，體外構建伴糖尿病牙周炎小鼠模型，免疫組化研究結果發(fā)現，HMGB1、RAGE 在糖尿病牙周炎牙齦組織中表達均顯著高于牙周炎組。該結果提示HMGB1、RAGE 參與了糖尿病牙周炎的發(fā)展[24]。高血糖可通過HMGB1/RAGE 信號軸持續(xù)激活NF-κB信號通路，釋放IL-6、TNF-α，加重糖尿病牙周炎病理過程。

持續(xù)的高糖環(huán)境能夠誘發(fā)炎癥反應的發(fā)生并引起氧化應激水平增高,HMGB1 是一種重要的炎性介質。二甲雙胍是Ⅱ型糖尿病的一線用藥，也是HMGB1 的抑制劑之一，其可直接結合HMGB1 并抑制其促炎活性。二甲雙胍和鹽酸二甲雙胍負載聚乳酸-乙醇酸納米顆?？蓽p輕大鼠牙周炎癥反應和骨吸收[25]，這表明二甲雙胍不僅可以降低血糖水平，還有阻斷HMGB1 的抗炎作用，可能對糖尿病牙周炎有效。研究表明，高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)牙齦上皮細胞，與對照組比較，HMGB1、RAGE、氧化應激指示劑8-OHdG 表達增加，抗氧化酶SOD 表達降低，毛蕊花苷通過抑制PKC/HMGB1/RAGE/NF-κB 信號通路，促進SOD 表達，抑制8-OHdG 的表達，并上調PGC1-α 和NRF1，促進線粒體的生物發(fā)生，降低氧化應激水平。HMGB1 在糖尿病和牙周炎之間的雙向關系中起到了重要作用。

3.HMGB1 對伴吸煙牙周炎的作用：在環(huán)境因素中，吸煙作為獨立危險因素導致慢性牙周炎加重已經成為共識，有研究發(fā)現，吸煙者患牙周炎的可能性高,是非吸煙者的4 倍[26]，且牙周病情重,有更嚴重的牙槽骨吸收,更深的牙周袋,而且治療效果差,但牙齦探診出血程度卻比不吸煙者輕,且戒煙后牙齦出血反而加重[27]。有實驗收集了伴吸煙慢性牙周炎患者、非吸煙慢性牙周炎患者和非吸煙牙周健康者的齦溝液樣本。ELISA 分析HMGB1 的水平發(fā)現，非吸煙慢性牙周炎患者齦溝液HMGB1 中值水平顯著高于伴吸煙慢性牙周炎患者和非吸煙牙周健康者，且伴吸煙慢性牙周炎患者和非吸煙牙周健康者間沒有顯著差異[3]。尼古丁抑制LPS 誘導的巨噬細胞中HMGB1 胞質易位，保留其核定位，表明尼古丁抑制HMGB1 釋放到細胞外。

孫立眾等對比吸煙及非吸煙慢性牙周炎患者的牙齦組織中HMGB1 的表達水平，結果顯示，HMGB1mRNA 在牙周炎組及健康對照組中，吸煙者表達均高于不吸煙者，且以吸煙牙周炎組的表達水平最高[28]。因此我們推測，吸煙及炎癥使HMGB1 的基因水平表達增加，而煙草中成分抑制其核移位。

目前吸煙對于牙周炎中HMGB1 的影響仍存在爭議。需進一步實驗證實吸煙通過何種特殊病理機制加重牙周炎癥，同時導致HMGB1 表達異常。

三、HMGB1 與牙周組織再生

牙周組織包括牙槽骨、牙周韌帶和牙骨質。牙周感染刺激HMGB1 的釋放，進而促進炎癥因子的分泌，導致牙齦出血，臨床附著喪失，牙周袋形成，牙槽骨吸收等。釋放的炎癥因子進一步促進HMGB1的分泌，引起炎癥的級聯放大反應，加重牙周炎癥及牙槽骨的吸收。

生理情況下，HMGB1 在大鼠下頜骨中破骨細胞表達較成骨細胞多，主要位于細胞質及細胞核中，牙齦卟啉單胞菌誘導牙周炎下頜骨組織中，成骨細胞表達多于破骨細胞，與對照組相比，2～6 周內HMGB1 在成骨細胞表達均升高，破骨細胞中2、3周HMGB1 高于正常組。HMGB1 在骨折血腫區(qū)域高表達，可促進間充質干細胞（MSCs）成骨分化，成骨細胞增殖及遷移，以及相關細胞因子的釋放，促進骨折愈合[29]。

牙周膜成纖維細胞的持續(xù)增殖、定向遷移和功能分化，是實現牙周組織再生修復的關鍵。Wolf 等研究證實，HMGB1 促進牙周膜成纖維細胞增殖、遷移，促進其堿性磷酸酶（ALP）、血清骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（osteocalcin,OC）、Runt 相關轉錄因子2（Runx2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的表達及礦化結節(jié)的形成，從而促進成骨分化[30]。此外，HMGB1 作為趨化因子對間充質干細胞具有趨化性?？贵w陣列分析研究發(fā)現HMGB1 作用于人骨髓間充質干細胞后，表皮生長因子受體（epidermal growth factor Receptor，EGFR）的表達上調，并激活下游Ras/MAPK 信號通路，促進其成骨分化[31]。TLR2、TLR4 及RAGE 在牙周組織再生中具有重要意義。rHMGB1 能顯著促進成骨細胞的遷移而不抑制其增殖。靶向構建TLR2 或TLR4特異性siRNA 可以顯著抑制HMGB1 誘導的成骨細胞遷移[32]。除此以外，HMGB1/RAGE 信號在口腔組織修復中也發(fā)揮重要作用。體外培養(yǎng)RAGE-/-牙齦成纖維細胞發(fā)現其增殖、遷移在再上皮化進程中被延遲。Biguettiet 等報道，HMGB1/RAGE 信號參與干細胞遷移，巨噬細胞M1/M2 極化和純鈦種植體成骨過程骨整合，抑制HMGB1 或RAGE 可促進巨噬細胞遷移并向M1 極化，影響骨沉積及骨基質成熟[33]。此外，HMGB1 可通過TLR2、TLR4 和RAGE 介導內皮細胞激活、血管生成[34,35]。據此我們推測，HMGB1 可能在牙周組織再生中起促進作用。

四、阻斷HMGB1 對牙周炎的治療作用

多項臨床研究證實：牙周炎患者齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）及血清中HMGB1 高表達，且牙周基礎治療后HMGB1 表達降低，HMGB1 水平與菌斑指數、出血指數、牙周袋深度、附著喪失正相關[3,21,36]。有大量研究表明，應用HMGB1 阻斷劑對牙周炎有抑制作用。甘草酸作為一種天然的三萜糖綴合物，天然分子甘草甜素是甘草根的一種成分，也已被測試以阻斷HMGB-1 效應，因為它直接與HMGB-1 結合，阻止其與配體受體的相互作用[37]。其廣泛應用于牙膏等口腔清潔用品中，Takeuchi-Hatanaka 等[38]通過隨機雙盲臨床試驗證實含有甘草酸的清潔用品可有效控制口腔炎癥。Ideguchi 等[39]通過組織學分析，牙周炎小鼠骨表面有大量的破骨細胞，骨表面有吸收腔，牙周組織有嗜中性粒細胞浸潤。甘草酸不僅能顯著降低破骨細胞的數量，而且還能顯著降低中性粒細胞的數量，說明甘草酸對牙周炎的發(fā)生有抑制作用。有研究發(fā)現[40]甘草酸可以抑制HMGB1 的釋放，從而保護造影劑損傷的HK-2細胞。由此我們可以推斷，甘草酸有可能是通過抑制HMGB1 的釋放從而控制牙周炎的進展。抗HMGB1 抗體是最有效的HMGB1 抑制劑之一，有研究表明[41]，抗HMGB1 抗體可以減弱GM-CSF、IL-1β等細胞因子的分泌，阻止了破骨細胞的長時間免疫刺激和骨吸收活性，從而抑制牙周炎的進展。咬合創(chuàng)傷是牙周炎重要的局部促進因素，Mika 等人在小鼠左下第一磨牙上制作咬合創(chuàng)傷模型，免疫組化研究證實：根分叉區(qū)骨吸收和破骨細胞形成逐漸增加，HMGB1、TLR4 和核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factors-κB ligand,RANKL）表達均增加。注射抗HMGB1 中和抗體，顯著減少分叉區(qū)破骨細胞的數量以及RANKL 和TLR4 的表達[42]。

牙周致病菌釋放毒性產物作用于宿主免疫防御系統，直接或間接促進HMGB1 的釋放，釋放的HMGB1 作用于鄰近細胞表面TLR2/4 及RAGE，產生促炎因子及趨化因子，如IL-8 及GM-CSF，遷移并分化免疫細胞，誘導其分泌促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及HMGB1，放大局部炎癥反應，加重的炎癥反應進一步促進破骨細胞的生成及牙槽骨的吸收。吸煙、糖尿病作為牙周炎的獨立危險因素，參與HMGB1 介導的牙周組織破壞。此外，HMGB1 可促進牙周膜成纖維細胞遷移及成骨、促進內皮細胞活化及血管再生。

雖然關于HMGB1 在牙周炎中雙重作用已有諸多研究，但其調控牙周炎免疫炎癥反應及牙周再生具體分子機制尚不完全明確。HMGB1 的不同結構域、不同氧化還原形式、分泌機制、刺激類型（有菌、無菌）如何通過相關細胞間信號轉導及其生物學效應參與牙周炎的發(fā)生及發(fā)展，將是未來研究的重點。