柳宇紅,姜宇,郝貴周*,劉善奎*

(1.濟南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟南 250022;2.山東新時代藥業(yè)有限公司科研部,山東 臨沂 273400)

脂質(zhì)體是指由磷脂和其他兩親性物質(zhì)分散于水相,頭部親水基團暴露于水相,尾部疏水基團聚集在一起而形成的、結(jié)構(gòu)類似生物膜的閉合微型空心囊泡[1-4],是近年來發(fā)展起來的一類新型的、理想的藥物輸送系統(tǒng),具有被動靶向性、緩釋性、低毒副作用等特點。目前,開發(fā)抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體制劑已成為研發(fā)熱點[1,5-6]。

卡巴他賽(Cabazitaxel)是第二代紫杉烷類藥物,具有廣譜抗腫瘤活性,對于耐藥性腫瘤具有良好抑制作用,臨床上主要用于治療激素難治性轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌。

脂質(zhì)體的粒徑和粒度分布對于藥物在體內(nèi)的藥動學(xué)行為具有很大影響[5,7],因此,如何控制脂質(zhì)體的粒徑是脂質(zhì)體制備過程中極其重要的一環(huán)?；诤丝啄さ臄D出法是脂質(zhì)體降低粒徑及粒徑均一化的最常用方法之一,具有里程碑的意義[8]。核孔膜的孔徑均一、孔型呈圓柱形、機械強度高、過濾速度快、截留特性好[7,9-10]。擠出法的工作原理是通過控制膜孔徑使脂質(zhì)體產(chǎn)生形變、破裂過膜,再重新組裝閉合,從而得到粒徑不同的新脂質(zhì)體,當(dāng)溫度高于相變溫度時有利于這一過程的進行[8]。通過擠出法可以制得粒度均勻且分布集中、包封體積大、載藥量高、體內(nèi)行為可預(yù)測性好的載藥脂質(zhì)體[8,11]。擠出法工藝簡便高效、重現(xiàn)性好、條件溫和,利于放大生產(chǎn)。本研究以平均粒徑(mean diameter,MD)和多分散指數(shù)(polydispersity,PDI)作為評價指標(biāo),通過考察擠出過程的多個影響因素來篩選卡巴他賽脂質(zhì)體最佳的擠出工藝參數(shù)。所用擠出系統(tǒng)示意圖如圖1,該系統(tǒng)由高壓氮氣作為動力源。

圖1 脂質(zhì)體擠出系統(tǒng)示意圖

1 儀器與試藥

1.1 試藥 卡巴他賽丙酮絡(luò)合物(北京福瑞康澤醫(yī)藥科技有限公司,卡巴他賽含量99.87%,批號:201111);大豆磷脂(德國Lipoid公司,含量99%,批號:579010-1190099-08);膽固醇(注射級,日本精化株式會社,批號:B80859);蔗糖(德國Merck公司,含量99%,批號:K52162992);無水乙醇(藥用級,安徽安特食品有限公司);注射用水(山東新時代藥業(yè)有限公司)等。

1.2 儀器 AE-100型脂質(zhì)體濾膜擠出器(加拿大ATS公司);0.4、0.2、0.08、0.05 μm的聚碳酸酯膜(美國Whatman公司);ZNCL-G310*150型智能磁力攪拌器(鄭州予華儀器制造有限公司);Zetasizer Nano ZS型Zeta電位與納米粒徑分析儀(英國Malvern公司);Sevencompact型pH計(瑞士Mettler Toledo公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 空白脂質(zhì)體及載藥脂質(zhì)體的制備 將處方量原輔料溶解于無水乙醇中,配得油相;適量蔗糖溶解于注射用水中配得蔗糖溶液,將其作為水相。接著,通過磁力攪拌將油相和水相混合,制得卡巴他賽脂質(zhì)體初乳。然后除去初乳中的乙醇,得到脂質(zhì)體混懸液。最后采用擠出技術(shù)進行整粒,得到卡巴他賽脂質(zhì)體成品。用同樣的方法,制備不加藥物的空白脂質(zhì)體。

2.2 脂質(zhì)體的粒徑測定

2.2.1 粒徑測定系統(tǒng)設(shè)置 MD和PDI是表征脂質(zhì)體粒徑的重要參數(shù),是脂質(zhì)體質(zhì)量評價的重要指標(biāo)之一。采用動態(tài)激光光散射技術(shù)(DLLS),利用粒徑測定儀測定卡巴他賽脂質(zhì)體的粒徑及其分布。測定條件為:溫度25 ℃,He/Ne激光器(λ=632.8 nm),折射角173°,折射指數(shù)1.343,黏度1.184 cP。懸浮液配制:用一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖水溶液將脂質(zhì)體稀釋33.3倍(即取30 μL脂質(zhì)體于1 mL 的蔗糖水溶液中混勻)后進行測試。

2.2.2 卡巴他賽脂質(zhì)體粒徑及其粒度分布的標(biāo)準(zhǔn) 基于藥典規(guī)定并參考已上市的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)體等脂質(zhì)體制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本研究對卡巴他賽脂質(zhì)體的粒徑作如表1的規(guī)定。

表1 卡巴他賽脂質(zhì)體的粒徑標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定

2.3 擠出工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗設(shè)計 參考已有文獻[8,12-13],本研究首先選出對擠出效果影響較大的5個因素,即膜孔徑(A,d/nm)、擠出次數(shù)(B,n)、擠出壓力(C,P/MPa)、擠出溫度(D,T/℃)、擠出時間(E,t/h)來進行正交試驗設(shè)計[12]以進行預(yù)試驗及風(fēng)險評估。試驗過程以空白脂質(zhì)體和載藥脂質(zhì)體(用于考察擠出時間對于擠出效果的影響)的MD值和PDI值作為評價指標(biāo)。

2.3.1.1 擠出壓力 本研究制得的脂質(zhì)體混懸液磷脂濃度為20 mg·mL-1(61.482 6 mmol·L-1)。由于磷脂濃度[8]影響脂質(zhì)體的擠出難易程度,在該磷脂濃度下需要較大的擠出壓力才能夠?qū)⒅|(zhì)體擠出,同時考慮到聚碳酸酯膜的最大承受壓力和擠出動力系統(tǒng)因素,本試驗選擇0.5、1、1.5、2 Mpa 4個水平來進行試驗。但是,由于80 nm膜擠出時,擠出壓力應(yīng)不小于1 MPa,否則不易擠出,因此,正交試驗設(shè)計時選擇1、1.5、2 Mpa 3個水平。

2.3.1.2 擠出溫度 考慮到磷脂為不飽和磷脂,相變溫度較低(-20 ℃),本研究選擇10～20 ℃、25～28 ℃兩個溫度水平來進行試驗設(shè)計。試驗結(jié)果如表2所示,可以發(fā)現(xiàn),較低溫度能夠得到較小粒徑的脂質(zhì)體,因此,選擇在10～20 ℃下進行擠出。

2.3.1.3 擠出時間的篩選 擠出時間是指脂質(zhì)體混懸液在進行擠出前于不同溫度下放置的時間。主要根據(jù)所制備脂質(zhì)體在室溫和4 ℃條件下的穩(wěn)定性來確定,選擇0～6 h、10～18 h、36～40 h 3個水平進行試驗設(shè)計。試驗結(jié)果如表2所示,可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)擠出時間在36～40 h時,脂質(zhì)體粒徑異常變大,尤其是室溫條件下儲存的時候,考慮可能是脂質(zhì)體漏藥所致;而擠出時間在0～6 h和10～18 h時,在低溫擠出或在室溫擠出對脂質(zhì)體的粒徑影響較小。

表2 擠出溫度與擠出時間對脂質(zhì)體粒徑的影響

2.3.1.4 擠出次數(shù) 選擇2次、3次及3次以上(以5次為例)3個水平進行試驗設(shè)計。

2.3.1.5 核孔膜孔徑的篩選 依據(jù)目標(biāo)脂質(zhì)體粒徑標(biāo)準(zhǔn)以及試驗具體過程來確定,選用400、200、80、50 nm 4個水平進行試驗。由于用50 nm膜擠出時,擠出壓力必須>1.5 MPa才能將脂質(zhì)體擠出,且流速較慢,因此正交試驗設(shè)計時不考慮50 nm這一水平。

各因素及水平匯總見表3,試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表4,正交試驗結(jié)果分析見表5。

表3 正交設(shè)計因素水平表

表4 正交設(shè)計方案及試驗結(jié)果

表5 正交設(shè)計試驗結(jié)果分析表

由表4、表5中所得結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),以MD值為評價指標(biāo)時,本研究3個因素的R值排列順序為A>B>C,即膜孔徑>擠出次數(shù)>擠出壓力,各因素水平分析結(jié)果為A為2<3<1,B為3<2<1,C為1<2<3,最優(yōu)擠出工藝為A2B3C1。以PDI為評價指標(biāo)時,本研究3個因素的r值排列為A>C>B,即膜孔徑>擠出壓力>擠出次數(shù),各因素水平分析結(jié)果為A:2<3<1,B:2<3<1,C:2<3<1,最優(yōu)擠出工藝為A2B2C2。此外,當(dāng)擠出時間為0～6 h且其他3個條件完全相同的情況下,擠出壓力的大小決定了擠出過程的難易與否,且隨著擠出次數(shù)的增加擠出會變得較容易,另外,膜孔徑越大越易于擠出,而低溫不改變擠出的難易程度。對于核孔膜孔徑和擠出次數(shù)而言,只能在一定程度上減小卡巴他賽脂質(zhì)體產(chǎn)品的粒徑,但均無法達(dá)到符合標(biāo)準(zhǔn)的粒徑和PDI。

擠出工藝優(yōu)化的目的是制備粒徑和粒度分布達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體制劑。綜合分析上述試驗結(jié)果并考慮各方面因素,本研究采用組合膜的思路來進一步縮小脂質(zhì)體粒徑,以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)[8]。主要的組合包括以下5種:400 nm+200 nm+80 nm;400 nm+80 nm;400 nm+80 nm+50 nm;200 nm+80 nm+50 nm;200 nm+80 nm。此外,其他試驗條件初步確定為:B=2次或3次,C=0.5～1.5 MPa,D=0～18 h,E=10～20 ℃。

2.3.2 部分正交析因法 本研究通過部分正交析因法[12-13]進一步進行了最佳擠出工藝的篩選,即在已確定的試驗條件下,考察膜組合(A)、擠出次數(shù)組合(B)、膜層數(shù)(C)3個因素對脂質(zhì)體擠出結(jié)果的影響。試驗設(shè)計及結(jié)果如表6所示。試驗過程以載藥脂質(zhì)體的MD值和PDI值作為評價指標(biāo)。

表6 試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表6結(jié)果顯示,A=200 nm+80 nm、B=3+3或2+3或3+2、C=單層或雙層,或A=400 nm+80 nm、B=2+3、C=單層時,脂質(zhì)體粒度均可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求,但是后者試驗結(jié)果波動較大。因此,工藝參數(shù)選擇為:A=200 nm+80 nm、B=3+3或2+3或3+2、C=單層或雙層。

綜合兩組試驗及其他因素,最終確定最佳的擠出脂質(zhì)體工藝為:膜組合為200 nm+80 nm(單層或雙層),擠出次數(shù)組合為3+3或3+2,擠出溫度為10～23 ℃,擠出時間控制在18 h內(nèi),擠出壓力為0.5～1.2 MPa。

3 最優(yōu)工藝驗證

按照上述正交試驗設(shè)計和部分正交析因法篩選得到的最佳工藝,以3+3(單層)、3+2(雙層)兩種膜組合來制備卡巴他賽脂質(zhì)體,每個組合各平行制備3批樣品,并考察各批次樣品在室溫和4 ℃下24 h內(nèi)的儲存穩(wěn)定性,以pH值、MD值和PDI值作為評價指標(biāo)。試驗結(jié)果如表7所示(最終結(jié)果均以各組合3批樣品所測得的各指標(biāo)的平均值來表示)?？梢园l(fā)現(xiàn),所得卡巴他賽脂質(zhì)體的粒徑顯著降低,粒徑分布范圍也明顯變窄,最終可以制得符合規(guī)定粒徑標(biāo)準(zhǔn)的卡巴他賽脂質(zhì)體混懸液。在室溫和4 ℃下,24 h內(nèi)pH、MD和PDI基本不變,儲存穩(wěn)定性良好。

表7 最優(yōu)擠出工藝下卡巴他賽脂質(zhì)體的粒徑及穩(wěn)定性考察

4 討論

本研究首先通過正交試驗設(shè)計法初步確定了卡巴他賽脂質(zhì)體最佳擠出工藝的參數(shù)范圍,隨后在此基礎(chǔ)上采用部分正交析因法對篩選出的參數(shù)范圍做了進一步的探索,最終確定了擠出過程的具體工藝參數(shù),為:濾膜組合為200 nm+80 nm(單層或雙層),擠出次數(shù)組合為3+3或3+2,擠出溫度為10～23 ℃,擠出時間控制在18 h內(nèi),擠出壓力為0.5～1.2 MPa。工藝驗證試驗表明,利用該組擠出工藝參數(shù)可以制得符合規(guī)定粒徑標(biāo)準(zhǔn)的卡巴他賽脂質(zhì)體產(chǎn)品。本研究為后續(xù)研究的順利進行奠定了堅實基礎(chǔ)。