王碩,張聰聰,姚曉敏

(浙江藥科職業(yè)大學(xué),浙江 寧波 315100)

原花青素是一類含雙黃酮衍生物的天然多酚類化合物,在自然界中分布廣泛,可從果蔬、花朵和樹皮中提取[1-2]。原花青素的結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基,結(jié)合其特定的分子立體化學(xué)結(jié)構(gòu),使得原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)人體內(nèi)自由基的有效清除,預(yù)防由氧化應(yīng)激引起的各種疾病,如心血管疾病等[3-5]。同時(shí)已有大量研究證明原花青素可預(yù)防和治療癌癥,是一類重要的天然來源藥物分子[6]。然而,由于原花青素在人體中主要在小腸被吸收,如果過早被口腔或胃中消化液破壞會(huì)大大降低其在機(jī)體內(nèi)的藥物活性[7]。因此,如何設(shè)計(jì)一個(gè)可控釋放的載體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原花青素分子的長(zhǎng)效傳遞成為一個(gè)重要的研究課題[8-10]。本研究以聚合物多孔薄膜作為表面介導(dǎo)的載體,實(shí)現(xiàn)了原花青素的高效加載和長(zhǎng)效釋放,并探討其中的釋放機(jī)制。

1 儀器與試劑

偏光顯微鏡(Imager.A2m)和激光共聚焦顯微鏡(LSM 780),都產(chǎn)自德國(guó)蔡司公司;場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI,Nova NanoSEM 650,USA);紫外可見雙光束分光度計(jì)(Mapada UV6100s),產(chǎn)自上海美譜達(dá)儀器有限公司;超聲波乳化儀(HN-500),產(chǎn)自上海漢諾公司。

聚苯乙烯(polystyrene,PS,Mw=1.92 × 105)和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;原花青素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;十二烷基二甲基溴化銨(didecyldimethylammonium bromide,DDAB)購(gòu)自Aladdin公司;三氯甲烷購(gòu)自杭州高晶化工;去離子水(18.2 MΩ cm-1)由超純水儀(HK Super PW)制得。

2 方法

2.1 聚合物平面薄膜的制備 將PS以10 mg·mL-1的濃度溶解在三氯甲烷中配制為溶液,在低環(huán)境濕度(25 ℃,RH≈25%)的條件下將PS溶液澆筑在干凈的固體基底上,待三氯甲烷揮發(fā)完后,在基底上形成厚度約為10 μm的聚合物平面膜片,然后放置在干燥皿中備用。

2.2 聚合物多孔薄膜的制備和原花青素的加載 在通過乳液加載原花青素并澆筑制備多孔膜的試驗(yàn)中,將DDAB作為乳化劑以0.5 mg·mL-1的濃度溶于三氯甲烷,另將原花青素以80 mg·mL-1的濃度溶于去離子水后與三氯甲烷溶液以一定比例(本文中使用了0.6%、1%、2%、2.6%、3.6%和4%共6種含水量來配制乳液)混合,用超聲乳化儀對(duì)混合液實(shí)施超聲乳化20 min,制備得到反相乳液。然后將反相乳液在潮濕的環(huán)境中(25 ℃,RH≈75%)澆筑在已經(jīng)制備好的PS平面膜上。待三氯甲烷和水揮發(fā)完畢后,將所獲得的多孔薄膜放置在干燥皿中進(jìn)行進(jìn)一步干燥。

在通過浸泡加載原花青素的試驗(yàn)中,首先按照前述步驟(區(qū)別是沒有加入原花青素)制備得到多孔膜樣品,然后將其置于原花青素的去離子水溶液中,在避光室溫條件下浸泡10 h,通過物理擴(kuò)散吸附過程實(shí)現(xiàn)原花青素在多孔膜樣品內(nèi)的浸泡加載。取出后放置在干燥皿中進(jìn)行進(jìn)一步干燥。

2.3 原花青素的釋放 采用索萊寶的植物原花青素含量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):BC1355),按照試劑盒說明書檢測(cè)溶液中原花青素濃度,檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm。首先利用紫外可見雙光束分光度計(jì)獲得基于已知濃度(0.078、0.156、0.312 5、0.625、1.25、2.5和5 mg·mL-1)的原花青素的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物加載薄膜所釋放的原花青素濃度。藥物釋放分析試驗(yàn)在37 ℃下進(jìn)行,將加載原花青素的薄膜浸入PBS緩沖液(pH 7.4)中。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn),取出藥物加載薄膜,按照試劑盒說明書用紫外可見分光度法對(duì)PBS釋放液進(jìn)行分析。取出的藥物加載薄膜重新浸泡入新制備的PBS緩沖液中,繼續(xù)釋放至下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。釋放測(cè)試持續(xù)28 d。通過將釋放原花青素的累積量除以薄膜所加載的原花青素總量,計(jì)算原花青素釋放的百分比。

3 結(jié)果

3.1 多層多孔薄膜的形貌調(diào)控 在本研究中,利用高濕度條件下溶劑澆筑致孔的方式來制備多孔聚合物薄膜。在這種基于水滴模板效應(yīng)的材料制備過程中,為了實(shí)現(xiàn)高孔隙率的致孔效果以及親水性藥物加載的目的,反相乳液被用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的純?nèi)軇w系實(shí)施澆筑致孔[11-12]。而在多孔藥物傳遞體系的設(shè)計(jì)中,多孔結(jié)構(gòu)的形貌參數(shù)將直接影響藥物釋放的行為[13-18]。因此我們通過改變反相乳液配方體系,評(píng)價(jià)其對(duì)所獲得多孔結(jié)構(gòu)的影響,特別是對(duì)表面層膜孔之下的本體層內(nèi)孔結(jié)構(gòu)的影響。我們制備了水相含量為0.6%、2.6%和3.6%的反相乳液,并通過乳液澆筑制備得到相應(yīng)的多孔載藥薄膜。圖1展示了3個(gè)條件下所制備的多孔樣品的表面和截面形貌。從表面結(jié)構(gòu)來看,3種條件下均獲得了規(guī)則的蜂窩狀陣列結(jié)構(gòu)的多孔形貌。而隨著乳液中水量的增加,表面膜孔尺寸隨之增大,但多孔陣列的規(guī)則度和孔徑的均一性均有所下降。而觀察本體層截面結(jié)構(gòu),其多孔結(jié)構(gòu)隨著水量的提升更是有了極大的變化,從低水量條件下所產(chǎn)生的亞微米尺寸的無序孔隙結(jié)構(gòu)(見圖1d),變?yōu)橹兴織l件下的微納尺寸復(fù)合多孔結(jié)構(gòu)(見圖1e),最后在高水量條件下,在本體層生成了與表面層膜孔的孔眼尺寸相當(dāng)?shù)奈⒚壮叽绱罂钻嚵?見圖1f),表面的有序膜孔陣列與本體層的無序多層膜孔共同構(gòu)成了有序/無序非對(duì)稱的復(fù)合形貌。因此,通過反相乳液澆筑致孔的方法,成功在平面薄膜上制備得到了孔洞形貌可調(diào)的多層多孔載藥聚合物薄膜。

a～c.表面光學(xué)顯微鏡照片;d～f.截面掃描電子顯微鏡照片;致孔乳液含水量:a和d.0.6%; b和e.2.6%; c和f.3.6%;標(biāo)尺:a～c.10 μm;d～f.5 μm圖1 由不同含水量的反相乳液所制備的多孔多層薄膜的表面光學(xué)顯微鏡照片和截面掃描電子顯微鏡照片

3.2 反相乳液加載水溶性組分可行性研究 為了表征水溶性組分在所獲得的多孔多層膜片中的分布情況,我們使用FITC作為熒光標(biāo)記物,代替原花青素加入水相中,利用澆筑致孔過程混入多孔薄膜,并通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察的方式進(jìn)行熒光素分布的追蹤表征。我們選取高含水量(3.6%)乳液配方條件下所制備的多孔膜片進(jìn)行觀察,從圖2a可見,綠色熒光信號(hào)組成了環(huán)狀陣列組裝形貌,并且熒光環(huán)之間間隔明顯,這種利用水滴模板過程結(jié)合反相乳液體系所獲得的熒光環(huán)形貌已在前期文獻(xiàn)被報(bào)道[19-22],證實(shí)了這種熒光分子在表面孔洞結(jié)構(gòu)內(nèi)壁處的選擇性分布,而三維重構(gòu)的CLSM數(shù)據(jù)(見圖2b～c)則進(jìn)一步確認(rèn)了這種環(huán)狀陣列形貌。同時(shí)三維重構(gòu)數(shù)據(jù)顯示熒光分子除了在表層的分布外,同時(shí)在本體層也實(shí)現(xiàn)了大范圍的分布。

a.表面及截面的切層照片;b～c.不同角度的三維重構(gòu)照片圖2 FITC在多孔多層薄膜中分布的CLSM照片

3.3 反相乳液加載原花青素及其釋放行為研究 前述結(jié)果證實(shí)了多層多孔聚合物薄膜的成功制備,以及水溶性組分可以通過致孔過程實(shí)現(xiàn)加載和選擇性的空間分布?；谶@一結(jié)果,我們進(jìn)一步表征了加載了原花青素的多孔薄膜的藥物分子釋放行為。圖3a是由圖1所示的3類水油比條件下所獲載藥薄膜樣品在28 d內(nèi)的釋放曲線圖。為了區(qū)分不同類型的樣品,用S1(使用1%含水量的乳液致孔獲得)、S2(2%含水量)和S3(4%含水量)分別代表3類條件下具有不同形貌特點(diǎn)的3種樣品。從結(jié)果中可以看到所有3種樣品均在釋放試驗(yàn)初期顯示出快速釋放的行為,在前8 h后均完成了20%～30%的釋放比例,而在此之后S1～S3都顯示出顯著的持續(xù)釋放行為,最終在長(zhǎng)達(dá)28 d的釋放試驗(yàn)結(jié)束時(shí)都還沒有達(dá)到完全釋放。其中S3在28 d后僅實(shí)現(xiàn)了64.92%的釋放,是3種樣品中實(shí)現(xiàn)了最長(zhǎng)效釋放效果的樣品。為了進(jìn)一步討論釋放過程的動(dòng)力學(xué)機(jī)理,Ritger-Peppas模型被用以進(jìn)行釋放數(shù)據(jù)的擬合(見圖3b),具體請(qǐng)見討論部分。作為對(duì)照,4種利用浸泡過程后加載原花青素的多孔膜樣品被用以開展原花青素的釋放試驗(yàn),圖3c中S0、S1′、S2′和S3′分別是使用0%、1%、2%和4%含水量乳液所制備的多孔膜,在利用浸泡過程加載原花青素之后4種樣品在前10 h后均完成了超過50%的釋放比例,而在不到100 h后均達(dá)到完全釋放。

4 討論

在本研究中,利用高濕度環(huán)境中反相乳液澆筑的方法在薄膜材料表面實(shí)現(xiàn)多孔多層結(jié)構(gòu)的制備。DDAB已被證明可輔助穩(wěn)定用于澆筑制備多孔薄膜的反相乳液[22],本研究中同樣使用了DDAB作為乳化劑配制反相乳液。綜合之前的報(bào)道,在此過程中環(huán)境凝結(jié)水滴和乳液液滴均能夠作為致孔結(jié)構(gòu)模板實(shí)現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)的構(gòu)建[19-22]。通過控制乳液中的水相比例,從而獲得乳液液滴在數(shù)量和尺寸上的調(diào)節(jié),最終實(shí)現(xiàn)表層和本體層多孔結(jié)構(gòu)的雙重調(diào)節(jié)(如圖1所示)。作為加載藥物分子的主要作用結(jié)構(gòu),多孔形貌所具有的動(dòng)態(tài)可控的屬性將為進(jìn)一步調(diào)控藥物釋放行為提供較好的基礎(chǔ)[8-9]。試驗(yàn)結(jié)果(見圖2)進(jìn)一步證明,利用乳液液滴加載藥物分子后直接參與致孔的方式可以實(shí)現(xiàn)藥物分子在所形成多層多孔結(jié)構(gòu)當(dāng)中的均勻分布,甚至在上表面的規(guī)則孔洞陣列中實(shí)現(xiàn)選擇性環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分布形貌。這種在高比表面積基體中實(shí)現(xiàn)所封裝藥物分子定向分布的結(jié)果,非常有利于實(shí)現(xiàn)藥物分子后續(xù)的長(zhǎng)效釋放。

圖3所示的釋放行為也證實(shí)了這種長(zhǎng)效釋放的效果。相比于浸泡加載的多孔薄膜樣品所呈現(xiàn)的短時(shí)間快速釋放(見圖3c),通過乳液液滴直接加載的薄膜樣品展示了極其優(yōu)異的長(zhǎng)效釋放性能(見圖3a)。而通過進(jìn)一步對(duì)比S1～S3的樣品釋放行為,我們發(fā)現(xiàn)在所加載藥物的量相同的條件下,含水量越高的乳液所制得的多孔薄膜藥品顯示出越長(zhǎng)效的釋放行為。這可以解釋為在含水量較高的條件下,乳液液滴能夠在本體層獲得孔徑更大和孔隙率更高的致孔效果并由此在本體層封裝入更多的藥物分子,有文獻(xiàn)表明這種上層有序下層無序的多孔薄膜作為藥物釋放載體,本體層的結(jié)構(gòu)更能起到儲(chǔ)備藥物實(shí)現(xiàn)緩釋的作用,而上表面的規(guī)則孔眼結(jié)構(gòu)則能有效地作為藥物擴(kuò)散的通路[23-24]。

為了進(jìn)一步揭示釋放動(dòng)力學(xué),我們用Ritger-Peppas方程(公式1)擬合了S3的釋放曲線[25-26]。

(1)

式中:Mt是時(shí)間t釋放藥物的累積量;Minf是無限時(shí)間釋放藥物的累積量;k是動(dòng)力學(xué)常數(shù);n是與釋放機(jī)制有關(guān)的釋放指數(shù)。通過將釋放數(shù)據(jù)代入公式1利用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。如圖3b中的擬合結(jié)果所示,n值小于0.5,S3釋放行為與Ritger-Peppas模型可以實(shí)現(xiàn)很好的吻合,表明該藥物釋放行為遵循Fickian擴(kuò)散機(jī)制[24]。使用Ritger-Peppas方程模擬的動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明,對(duì)于像原花青素這種水溶性藥物分子,本研究中所獲得的多孔多層薄膜是一種可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期緩慢釋放效果的理想藥物載體體系。

綜上,本研究提出了一種針對(duì)原花青素藥物分子實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效緩釋目的的藥物載體體系,利用加載了原花青素的反相乳液進(jìn)行薄膜表面澆筑的方式成功制備得到了具有多層多孔結(jié)構(gòu)的藥物加載多孔薄膜,并證實(shí)其可實(shí)現(xiàn)基于Fickian擴(kuò)散機(jī)制的長(zhǎng)效藥物釋放行為。本研究將為設(shè)計(jì)高效靈活的藥物釋放體系提供有效的參考。