劉春影, 周 婷, 李佳蔭,3, 梅 竹, 楊晢銘,3, 張 艷, 劉 丹, 宋海旭

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016;2.中國醫(yī)科大學,遼寧 沈陽 110122;3.東北大學,遼寧 沈陽 110167

骨骼肌為人體最具活力與可塑性的組織之一,約占人體總體質(zhì)量的40%[1]。作為氨基酸與碳水化合物等重要底物的存儲場所,骨骼肌能夠產(chǎn)生熱量以維持核心溫度[2-3]。線粒體為調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝的重要細胞器,通過調(diào)整其體積、結(jié)構(gòu)與功能來應對慢性運動、衰老及疾病等。線粒體為高度動態(tài)的細胞器,經(jīng)歷裂變和融合的協(xié)調(diào)循環(huán),稱為“線粒體動力學”,以保持其形狀、分布和大小[4-6]。熱休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)為一種線粒體的分子伴侶蛋白,可維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[7-8]。有研究證實,Hsp60參與多種細胞與組織的線粒體自噬過程,并與骨骼肌線粒體的發(fā)生與肌纖維的生成存在相關(guān)性[9-10]。本研究旨在探討Hsp60對骨骼肌線粒體動力學穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5只8周齡雄性健康C57/BL小鼠,體質(zhì)量20～25 g,購自集萃藥康生物有限公司。經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物管理委員會批準,標準飼養(yǎng)條件,室內(nèi)溫度 22℃,保持 12 h晝夜節(jié)律。

1.2 研究方法

1.2.1 C2C12細胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 小鼠成肌細胞系C2C12購自ATCC公司,培養(yǎng)條件為37℃,5%二氧化碳,并應用10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。當細胞密度達到80%時,可進行干擾RNA(siHsp60)與對照試劑轉(zhuǎn)染,分別設為siHsp60組與對照組。

1.2.2 免疫熒光染色與MitoTracter染色 小鼠麻醉后,取腓腸肌樣本,以4%多聚甲醛固定24 h后脫水、石蠟包埋、脫蠟、伊紅染色與乙醇脫水。孵育一抗Hsp60與TOMM20,以4℃過夜。第2天復溫30 min,加入熒光二抗,室溫避光 1 h。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染細胞核,拍照后分析數(shù)據(jù)。C2C12細胞應用線粒體紅色熒光探針染色 15～30 min,染核,拍照分析。

1.2.3 Western blot法 在siHsp60 組與對照組細胞中加入RIPA buffer蛋白裂解液,冰上裂解30 min,4℃溫度下,以12 000 r/min離心10 min。等量樣本通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V,1 h)分離,蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h,孵育一抗。TBST緩沖液清洗3次后,加入二抗孵育2 h,TBST清洗4次,增強型化學發(fā)光試劑曝光,分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 透射電鏡 采用2%戊二醛將siHsp60 組與對照組細胞在4℃條件下固定24 h。對樣品進行不同處理步驟,如固定、梯度乙醇脫水、置換,然后用透射電鏡成像,采用iTEM軟件對線粒體的數(shù)量與大小進行形態(tài)測量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsp60在小鼠骨骼肌與C2C12細胞系線粒體中表達 在小鼠腓腸肌中Hsp60與線粒體膜蛋白標記分子TOMM20有共定位表達(圖1a),在骨骼肌成肌細胞系C2C12中同樣發(fā)現(xiàn)Hsp60與TOMM20有共定位表達(圖1b)。

圖1 Hsp60在骨骼肌線粒體中表達情況(a.免疫熒光染色檢測Hsp60與TOMM20在骨骼肌腓腸肌中表達情況;b.免疫熒光染色檢測Hsp60與TOMM20在C2C12細胞中表達情況)

2.2 Hsp60敲減后線粒體形態(tài)的變化 與對照組比較,siHsp60 組細胞中異常線粒體的數(shù)量顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。siHsp60組細胞中線粒體呈點狀和碎裂的狀態(tài),而對照組細胞中線粒體形態(tài)規(guī)則,呈長棒狀。見圖3。

圖2 透射電鏡檢測細胞中異常線粒體的表達(a.透射電鏡檢測C2C12細胞中線粒體的表達情況;b.統(tǒng)計學分析)

圖3 MitoTracker紅色探針染色檢測細胞中線粒體表達

2.3 Hsp60敲減后線粒體動力蛋白的表達變化 Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,siHsp60組細胞中線粒體融合蛋白(optic atrophy 1,OPA1)表達量顯著降低,而線粒體分裂與融合蛋白即動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)表達量顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 線粒體蛋白OPA1與DRP1表達情況(a.Western blot法檢測線粒體中OPA1與DRP1蛋白的表達情況;b.統(tǒng)計學分析)

3 討論

線粒體在細胞中起到重要作用,包括調(diào)控能量供應、Ca2+穩(wěn)態(tài)與細胞凋亡等。骨骼肌細胞通過線粒體動力學(融合與裂變)等途徑維持線粒體的形態(tài)與生理學功能[11-12]。年齡引發(fā)的骨骼肌萎縮為世界范圍內(nèi)的一個主要健康問題[13]。線粒體動力學損傷為導致骨骼肌萎縮的主要機制之一。

本研究結(jié)果顯示,Hsp60在骨骼肌纖維與C2C12細胞系的線粒體中大量表達。這提示,Hsp60可能在線粒體的生物活性中發(fā)揮重要作用。Hsp60作為一種線粒體蛋白,在調(diào)節(jié)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用[14]。有研究報道,Hsp60不僅定位線粒體,在細胞質(zhì)、質(zhì)膜和胞外,以及血液循環(huán)中均有表達,不僅調(diào)控線粒體伴侶活性,還在細胞增殖、凋亡、遷移和免疫應答等多種細胞過程中發(fā)揮作用[15-16]。在C2C12細胞中給予Hsp60敲減后,透射電鏡發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中異常的線粒體數(shù)量增加,MitoTracker紅色探針染色檢測發(fā)現(xiàn)線粒體的形態(tài)發(fā)生改變,分裂的線粒體數(shù)量增多。線粒體為一個動態(tài)細胞器,不斷發(fā)生裂變和融合,以使其形態(tài)適應細胞環(huán)境。本研究Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,siHsp60組細胞中OPA1表達量顯著降低,而DRP1表達量顯著升高(P<0.05)。這提示,Hsp60減少可引起線粒體動力蛋白的表達異常。有研究證實,Mfn1與 Mfn2雙基因骨骼肌特異性敲除的小鼠骨骼肌中線粒體破壞,骨骼肌運動功能嚴重損傷[17-20]。OPA1的特異性敲除同樣會導致骨骼肌線粒體功能障礙、氧化應激反應和炎癥等。骨骼肌特異性DRP1基因敲除會引起骨骼肌萎縮,再生障礙。

綜上所述,Hsp60作為線粒體伴侶蛋白,可能參與維持線粒體的動力學穩(wěn)態(tài),在骨骼肌萎縮等病理過程中發(fā)揮重要作用。