趙曉杰, 閆 冰, 劉 丹, 張大力, 何佳奇

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽(yáng) 110016

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)蛋白是一種富含精氨酸的血漿載脂蛋白,參與乳糜微粒殘?bào)w、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的一些亞類等脂質(zhì)的代謝,與特定細(xì)胞表面的受體和硫酸肝素蛋白聚糖相互作用,將其從血漿循環(huán)中清除[1]。為研究ApoE與人類疾病的關(guān)系,如動(dòng)脈粥樣硬化[2]、肥胖[3]、糖尿病[4]及阿爾茲海默癥[5]等,ApoE背景(ApoE-/-)小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是一種含有220個(gè)氨基酸的進(jìn)化保守的糖蛋白,結(jié)構(gòu)類似于氧化還原酶,具有高度保守性,人類與小鼠的CREG基因高度同源[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),CREG可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同細(xì)胞增殖、分化、凋亡等,對(duì)心血管及代謝疾病產(chǎn)生影響,且在調(diào)節(jié)肝糖脂代謝方面也具有重要作用[7]。本研究旨在建立ApoE-/-CREG轉(zhuǎn)基因(CREGTg)小鼠模型,為進(jìn)一步探討CREG在動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中的作用及機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)工具?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與配繁方案 3只雄性ApoE-/-小鼠和9只雌性CREGTg小鼠均購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。首先,將雄性ApoE-/-小鼠與雌性CREGTg小鼠進(jìn)行交配,獲得雄性ApoE+/-小鼠和雌性ApoE+/-CREGTg小鼠(或雌性ApoE+/-小鼠和雄性ApoE+/-CREGTg小鼠),再將兩者進(jìn)行交配,以獲得ApoE-/-CREGTg小鼠。

1.2 主要試劑 CREG一抗、ApoE一抗(英國(guó)Abcam公司);Gapdh抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology);HRP標(biāo)記的二抗(美國(guó)Jackson Immuno Research);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA);蛋白裂解液RIPA(美國(guó)Thermofisher Scientific);引物合成(生工生物工程股份有限公司)。

1.3 基因型鑒定 子代小鼠滿4周時(shí),分籠并打耳釘進(jìn)行編號(hào)。提取鼠耳基因組DNA,具體方法:將小鼠耳放于裂解液中(含蛋白酶K),55℃水浴鍋2 h,95℃水浴鍋5 min終止消化,12 000 r/min離心5 min,上清即為提取的DNA。然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系:gDNA Template 2 μl,10×Taq master mix 10 μl,Primer mix(10 mol/L)1 μl,水補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件:(1)95℃、5 min;(2)95℃、30 s;(3)58℃、30 s;(4)72℃、30 s;(2)～(4)共40個(gè)循環(huán);(5)72℃、3 min;(6)25℃保持。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳及基因型鑒定。

表1 ApoE-/-CREGTg小鼠基因型鑒定

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)CREG轉(zhuǎn)基因表達(dá) 選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠及ApoE-/-CREGTg小鼠各3只,處死后分離各組小鼠脂肪組織和脾組織,采用Trizol法提取脂肪組織和脾組織的總RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。CREG正向引物TCTAAAAGACCTAACCGGAA,反向引物ACCGGAACGGCACTGGTCAAC;GAPDH正向引物AGGTCGGTGTGAACGGATTTG,反向引物GGGGTCGTTGATGGCAACA。相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT表示。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)CREG蛋白表達(dá) 選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠及ApoE-/-CREGTg小鼠各3只,處死后取20 mg脂肪組織和20 mg脾組織,加入200 μl蛋白裂解液對(duì)組織進(jìn)行裂解,4℃放置30 min,12 000 r/min離心5 min,上清即為提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-PAGE膠對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳。一抗采用抗CREG抗體,二抗為HRP標(biāo)記的抗體,Gapdh為內(nèi)參基因。一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育1 h后洗膜,再用化學(xué)發(fā)光試劑ECL對(duì)條帶進(jìn)行顯影。采用Image-ProPlus 6.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 ApoE-/-CREGTg小鼠獲得情況 共有孕鼠13只,共產(chǎn)仔73只。對(duì)子代小鼠進(jìn)行基因鑒定,共發(fā)現(xiàn)6種基因型,分別為ApoE+/+小鼠9只(12.33%),ApoE+/+CREGTg小鼠10只(13.70%),ApoE+/-小鼠19只(26.03%),ApoE+/-CREGTg小鼠16只(21.92%),ApoE-/-小鼠8只(10.95%),ApoE-/-CREGTg小鼠11只(15.07%)。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定結(jié)果[a.PCR擴(kuò)增鑒定CREG轉(zhuǎn)基因,CREG引物1=371 bp,引物2=360 bp;b.PCR擴(kuò)增鑒定ApoE背景,野生型=155 bp,突變型=245 bp;本批次樣本中ApoE+/+小鼠:5,7;ApoE+/+CREGTg小鼠:無(wú);ApoE+/-小鼠:3,9;ApoE+/-CREGTg小鼠:6;ApoE-/-小鼠:2;ApoE-/-CREGTg小鼠:1,4,8;對(duì)照組:10為C57BL/6J(ApoE+/+)小鼠;11為ApoE-/-CREGTg小鼠;12為水]

2.2 小鼠脂肪組織與脾組織CREG轉(zhuǎn)錄水平 ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織的CREG轉(zhuǎn)錄水平高于ApoE-/-小鼠,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織CREG轉(zhuǎn)錄水平(a.脂肪組織;b.脾組織)

2.3 小鼠脂肪組織與脾組織CREG蛋白表達(dá)水平 ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織的CREG蛋白表達(dá)高于ApoE-/-小鼠,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織與脾組織CREG蛋白表達(dá)(a、b.脂肪組織蛋白表達(dá);c、d.脾組織蛋白表達(dá))

由于生物物種具有雜合子優(yōu)勢(shì)[17-20],本研究的F2代選取了鑒定后的雜合子小鼠,以提高小鼠品性及子代小鼠的穩(wěn)定性。通過(guò)雄性ApoE+/-小鼠和雌性ApoE+/-CREGTg小鼠交配,成功獲得ApoE-/-CREGTg小鼠。熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織和脾組織的CREG基因轉(zhuǎn)錄水平高于ApoE-/-小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ApoE-/-CREGTg小鼠脂肪組織和脾組織的CREG蛋白表達(dá)高于ApoE-/-小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性及轉(zhuǎn)基因效率,提示可繁育ApoE-/-CREGTg小鼠動(dòng)物模型用于動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述,本研究成功建立了ApoE-/-CREGTg小鼠模型,為深入闡明CREG對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的調(diào)控作用及機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)工具。

3 討論

ApoE是分子量為34 kD的糖蛋白,參與脂質(zhì)在不同組織或細(xì)胞的分布和再分布,具有抗氧化、抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化的特性。ApoE蛋白的主要功能是介導(dǎo)血漿或組織間液中脂蛋白或脂質(zhì)復(fù)合物與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合,小鼠ApoE基因缺陷會(huì)影響極低密度脂蛋白和乳糜微粒的清除[1,8-10]。Piedrahita等[11]通過(guò)同源重組在胚胎干細(xì)胞中操縱ApoE基因,在實(shí)驗(yàn)室中成功產(chǎn)生了第一個(gè)ApoE-/-小鼠品系。與野生型小鼠比較,ApoE-/-小鼠的血漿總膽固醇水平明顯升高[12],使其成為動(dòng)脈粥樣硬化疾病及相關(guān)藥物研發(fā)的重要工具。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),CREG能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)皮化[6,13-16]。為進(jìn)一步探究CREG對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的調(diào)控作用及機(jī)制,本課題組擬在ApoE-/-小鼠中過(guò)表達(dá)CREG,從而建立ApoE-/-CREGTg小鼠模型,以便更直接地研究CREG對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的影響。