夏建洪 周立慶 嚴(yán)研 馬婷婷 蘇欣宇

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科腫瘤之一[1-2],發(fā)病率和死亡率較高[3]。因此,探究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)提高子宮內(nèi)膜癌患者的生存率至關(guān)重要。研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)在子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療中具有廣闊的前景。子宮內(nèi)膜癌中的lncRNA表達(dá)與腫瘤分級(jí)和患者生存率有關(guān)[4-6]。DUXAP8(Double homeobox A pseudogene 8)是來源于假基因的lncRNA[7],越來越多的研究表明DUXAP8在非小細(xì)胞肺癌[8]、腎透明細(xì)胞癌[9]和膀胱癌[10-11]等多種癌癥中表達(dá)顯著上調(diào),發(fā)揮促癌作用。然而目前尚未見到有關(guān)于lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道。因此,本研究旨從生信數(shù)據(jù)庫挖掘出發(fā),分析lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系,探究lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中的作用及其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生信分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的RNA-seq數(shù)據(jù),對(duì)lncRNA DUXAP8表達(dá)數(shù)據(jù)(腫瘤組織:552;配對(duì)組織:35)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以DUXAP8在所有樣本(n=541)里面表達(dá)量的中位數(shù)作為閾值,將樣本分為DUXAP8高表達(dá)組(n=270)和DUXAP8低表達(dá)組(n=271)。使用R語言繪制DUXAP8高低表達(dá)組患者的生存曲線。基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),設(shè)置20個(gè)月生存期結(jié)局事件為“死亡”,至10個(gè)月時(shí),以結(jié)局事件為“死亡”的病例人數(shù)出現(xiàn)斷崖式下降,可能是因?yàn)槌瞬糠衷谟^察終點(diǎn)前失去聯(lián)系或退出實(shí)驗(yàn)的患者刪失外,由于這些患者均為未接受治療的患者,從觀察開始至10個(gè)月時(shí)患者已到達(dá)結(jié)局事件。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

正常人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞系hESC及人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系HEC-1A、Ishikawa、RL-95-2和JEC均購自北納生物。hESC和Ishikawa細(xì)胞系在含10% FBS的EMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),JEC細(xì)胞系在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),RL-95-2細(xì)胞系在含有10% FBS的D-MEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng),HEC-1A細(xì)胞系在含有10% FBS的McCOY′s 5A(添加NaHCO32.2 g/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。上述所有細(xì)胞系均在95%空氣、5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

使用RNAiMAX(Invitrogen)將靶向DUXAP8(Invitrogen)的小干擾RNA(siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEC-1A細(xì)胞中,具體步驟如下:轉(zhuǎn)染時(shí)在50 μL Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)基中稀釋6 pmol siRNA雙鏈體,之后在50 μL Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)基中加入1 μL RNAiMAX,然后將siRNA雙鏈體稀釋液和RNAiMAX稀釋液混合,室溫孵育20 min。將上述混合液加入?yún)R合度約為30%～50%的細(xì)胞培養(yǎng)孔中(24孔板,2 000～5 000個(gè)細(xì)胞/孔),搖動(dòng)培養(yǎng)板輕輕混合。在95%空氣、5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

使用Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen)將購自銳博的Vector和DUXAP8轉(zhuǎn)染到HEC-1A細(xì)胞系中。具體步驟如下:轉(zhuǎn)染時(shí)在50 μL Opti-MEM?培養(yǎng)基中稀釋1 μg質(zhì)粒DNA,之后在50 μL Opti-MEM?培養(yǎng)基中加入5 μL Lipofectamine 2000,將DNA質(zhì)粒稀釋液和Lipofectamine 2000稀釋液混合,室溫孵育5 min。將上述混合液加入?yún)R合度約為70%～90%的細(xì)胞培養(yǎng)孔中(24孔板,5 000～20 000個(gè)細(xì)胞/孔),搖動(dòng)培養(yǎng)板輕輕混合。在95%空氣、5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

本研究設(shè)置了5組,不做任何轉(zhuǎn)染處理的空白對(duì)照組(Control組),DUXAP8過表達(dá)對(duì)照組(Vector),DUXAP8過表達(dá)組(DUXAP8),DUXAP8敲低表達(dá)對(duì)照組(si-NC),DUXAP8低表達(dá)組(si-DUXAP8),所有組別均進(jìn)行細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

用TRIzol試劑(Invitrogen)裂解細(xì)胞分離總RNA。通過微量分光光度計(jì)評(píng)估RNA質(zhì)量和濃度。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa),在標(biāo)準(zhǔn)條件下,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照制造商的說明,使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)測(cè)定DUXAP8的表達(dá)水平?？偡磻?yīng)體系為25 μL:SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5,PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL,PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μL,cDNA(約100 ng)2 μL,水9.5 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min 1個(gè)循環(huán),95℃變性30 s,58℃退火1 min,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。將結(jié)果用GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)化,表達(dá)量采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。具體的引物如下:DUXAP8:正向引物:5′-GAGAAGCAGT GGTGGGTTCC-3′,反向引物:5′-GAGCAACACAGATGAACCGC-3′;GAPDH:正向引物:5′-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3′,反向引物:5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3′。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

來自細(xì)胞裂解液的蛋白質(zhì)通過10% SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移至0.22 μm硝酸纖維素(NC)膜(Sigma),并與特異性一抗孵育過夜。然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的IgG H&L(Abcam,稀釋濃度1∶10 000)孵育2 h。室內(nèi)溫度下使用化學(xué)發(fā)光底物(ECL)(ThermoFisher)進(jìn)行定量蛋白質(zhì)表達(dá)。GAPDH用作內(nèi)參蛋白。所用一抗均購自Abcam(表1)。

表1 Western blot一抗產(chǎn)品信息

1.5 細(xì)胞增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行CCK-8分析以評(píng)估DUXAP8或干擾的siRNA轉(zhuǎn)染后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生存能力。轉(zhuǎn)染48 h后,將細(xì)胞(2 000個(gè)/孔)接種到96孔板中。并在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度值來確定每個(gè)孔中的活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。

為了進(jìn)行克隆形成測(cè)定,將五組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)兩周。然后,將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲能力,進(jìn)行了Transwell測(cè)定。將300 μL無血清的5×104個(gè)細(xì)胞加入有基質(zhì)膠包被的8 mm膜的上培養(yǎng)室中。然后,將含有10%胎牛血清的700 μL培養(yǎng)基添加到12孔板的下培養(yǎng)室中。溫育24 h后,用棉絨除去室上部膜上的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定,并用0.1%結(jié)晶紫染色。對(duì)染色的細(xì)胞成像,并選擇6個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

采用劃痕愈合試驗(yàn)評(píng)估子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移能力。將細(xì)胞鋪在6孔板上,并用移液器吸頭刮擦,以產(chǎn)生均勻的傷口。每個(gè)孔用PBS洗滌3次以除去漂浮細(xì)胞。對(duì)于每組,以40倍的放大倍率在顯微鏡下檢測(cè)初始距離(0 h)和細(xì)胞在刮擦24 h后的距離。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后48 h,通過胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞,并使用FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中FITC-Annexin V和碘化丙啶(PI)雙重染色。然后,用配備有CellQuest軟件的流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。按照制造商的規(guī)程,使用CycleTEST PLUS DNA試劑盒中PI對(duì)細(xì)胞周期分析的細(xì)胞進(jìn)行PI染色,然后通過FACScan進(jìn)行分析。確定并比較了G0/G1、S和G2/M相中的細(xì)胞比例。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較,單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,重復(fù)測(cè)量資料使用重復(fù)測(cè)量方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布,則采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線,Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)

通過TCGA數(shù)據(jù)庫中子宮內(nèi)膜癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌組織中明顯上調(diào)(P<0.001)(圖1A)。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫的臨床數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)DUXAP8高表達(dá)患者(n=270)總生存率明顯低于低表達(dá)患者(n=271)(P=0.0054)(圖1B),并且DUXAP8隨著腫瘤的進(jìn)展表達(dá)量逐漸增加(stage Ⅰ～Ⅳ的患者分別為339例、51例、124例、29例,P=0.0045)(圖1C)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示與正常細(xì)胞系(hESC)相比,DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(HEC-1A、Ishikawa、RL-95-2、JEC)中高表達(dá)(4.50±0.40,3.58±0.35,2.29±0.23,2.83±0.28vs.1.00±0.10)(P<0.001)(圖1D),本研究選擇表達(dá)水平最高的HEC-1A細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)水平

2.2 DUXAP8促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖

對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A中的lncRNA DUXAP8進(jìn)行過表達(dá)處理及沉默處理,并用qRT-PCR檢測(cè)其表達(dá)效率,結(jié)果顯示各組lncRNA DUXAP8表達(dá)水平符合預(yù)期(2.20±0.22vs.1.10±0.12,0.45±0.06vs.1.08±0.11,P<0.01)(圖2A),可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖及克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)DUXAP8能夠增強(qiáng)HEC-1A細(xì)胞的增殖和克隆形成能力,而抑制DUXAP8表達(dá)的結(jié)果則相反(P<0.05)(圖2B,圖2C)。

圖2 DUXAP8對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖的影響

2.3 DUXAP8調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程

Transwell和劃痕愈合分析顯示DUXAP8過表達(dá)促進(jìn)HEC-1A細(xì)胞侵襲和遷移,而沉默DUXAP8結(jié)果則相反(P<0.01)(圖3A,圖3B)。采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明DUXAP8過表達(dá)能夠抑制E-Cadherin和Claudin-1蛋白的表達(dá),同時(shí)上調(diào)N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)。同樣,若沉默DUXAP8結(jié)果則相反(圖3C)。

圖3 LncRNA DUXAP8調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲、遷移和EMT過程

2.4 DUXAP8調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期及其凋亡

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定過表達(dá)及沉默lncRNA DUXAP8對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A的細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP8的表達(dá)量影響了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的細(xì)胞周期,過表達(dá)組細(xì)胞多處在S期,而沉默lncRNA DUXAP8將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A,圖4B)。此外,細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)lncRNA DUXAP8抑制了細(xì)胞凋亡(P<0.05),而沉默lncRNA DUXAP8促進(jìn)了細(xì)胞凋亡(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4C,圖4D)。

圖4 DUXAP8調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期及其凋亡

3 討論

目前,已有研究表明lncRNA的表達(dá)失調(diào)與許多癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。其中在子宮內(nèi)膜癌中,許多表達(dá)失調(diào)的lncRNA參與一些重要的生物學(xué)和病理學(xué)過程。比如lncRNA CHL1-AS1通過吸附miR-6076調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌中的CHL1表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[13];lncRNA FER1L4通過提高子宮內(nèi)膜癌中的PTEN表達(dá)并抑制Akt信號(hào)通路的磷酸化發(fā)揮抑癌作用等[14],但是lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌中的生物功能目前尚不清楚。已有研究證明,lncRNA DUXAP8常在惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[12]。為了探究其在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)功能,本研究通過生信分析發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)顯著上調(diào),與Stage分期呈正相關(guān),而與總體生存率呈負(fù)相關(guān),這與Lin等[11]報(bào)道lncRNA DUXAP8在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)且與TNM分期正相關(guān),與總體生存率負(fù)相關(guān)一致。

一般來說,lncRNA DUXAP8被認(rèn)為是促癌因子[15],在包括食管鱗癌[16]在內(nèi)的大多數(shù)癌癥中表達(dá)上調(diào),比如高表達(dá)的lncRNA DUXAP8通過與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)或組蛋白脫甲基酶(LSD1)互作來抑制KLF2,EGR1、RHOB和PLEKHO等抑癌因子的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8,17]。本研究通過一系列細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探尋lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)lncRNA DUXAP8后,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng),上皮表型相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)、間質(zhì)表型相關(guān)蛋白表達(dá)明顯上調(diào),這說明lncRNA DUXAP8能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)程。沉默lncRNA DUXAP8則和Du等[18]報(bào)道一致,癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力受到了顯著抑制。Ji等[19]發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP8在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào),發(fā)揮促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和EMT進(jìn)程的作用,此外也有研究證實(shí)lncRNA DUXAP8能夠誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程[20],這與本研究結(jié)果相一致,說明lncRNA DUXAP8能在多種癌癥中促進(jìn)EMT進(jìn)程的發(fā)展。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)lncRNA MIR31HG通過靶向HIF1A和P21,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而促進(jìn)頭頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。Hu等[22]也報(bào)道了PLAC2通過調(diào)節(jié)RPL36表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的G1/S期阻滯。這表明lncRNA可能通過影響細(xì)胞周期對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。我們?cè)诔聊琹ncRNA DUXAP8后,發(fā)現(xiàn)分布在G0/G1期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞顯著增加、在S期的細(xì)胞顯著減少并且細(xì)胞凋亡率顯著上升,這表明沉默lncRNA DUXAP8很可能將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。本文首次研究了lncRNA DUXAP8對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,豐富了子宮內(nèi)膜癌中細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)的研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP8在子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá),并與子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后及腫瘤進(jìn)展有關(guān),有潛力成為子宮內(nèi)膜癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。此外,本研究揭示了lncRNA DUXAP8具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用。這可能是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT過程、促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期并且抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。這些分析數(shù)據(jù)可以為子宮內(nèi)膜癌的診斷或靶向治療提供有價(jià)值的lncRNA候選物。但是,本研究存在一些局限性,僅對(duì)lncRNA DUXAP8功能進(jìn)行了驗(yàn)證,并未研究其潛在的分子機(jī)制,這將在我們的未來研究中進(jìn)一步探討。