賴盛聯(lián),毛 敏,黃 林

(廣西壯族自治區(qū)欽州市第一人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,廣西 欽州 535000)

甲狀腺癌是主要由甲狀腺濾泡上皮惡變發(fā)展而來的頸部腫瘤,占全身惡性腫瘤的1%,好發(fā)于女性,男女發(fā)病比例1∶3.03,近年來甲狀腺癌發(fā)病率呈快速增長和年輕化趨勢[1]。大多數(shù)甲狀腺癌分化程度高,生長緩慢,病死率低,但是早期易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,即便接受根治手術(shù),術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移風(fēng)險[2],降低患者生存率和生存質(zhì)量。明確甲狀腺癌高危病變相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志對指導(dǎo)治療、預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險和預(yù)后均有重要意義。癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子6(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6,CEACAM6)是癌胚抗原家族成員,其過表達可促使細胞異常分化、抑制細胞凋亡、促使細胞生長,并增強對治療劑的抵抗,促使癌癥發(fā)生和進展[3]。miR-146b是轉(zhuǎn)錄后基因沉默因子,在前列腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào),促進癌細胞生長和侵襲[4]。鈣結(jié)合蛋白A6(calcium-binding protein A6,S100A6)是S100鈣結(jié)合蛋白家族的成員,可促進結(jié)直腸癌、肝細胞癌、骨肉瘤和胰腺癌細胞增殖,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移[5]。本研究擬探討CEACAM6、miR-146b、S100A6與甲狀腺癌臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系,以期為臨床病情分析和預(yù)后判斷提供參考。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2016年10月—2018年10月我院收治的甲狀腺癌患者165例,男性41例,女性124例,年齡30～52歲(<40歲96例、≥40歲69例);病理類型:乳頭狀癌85例,濾泡狀癌50例,未分化癌18例,髓樣癌12例;腫瘤直徑:>1 cm 82例,≤1 cm 83例;分化程度:低中度分化47例,高度分化118例;T分期:T1～T2期93例,T3～T4b期72例;N分期:N073例,N1a～N1b92例。納入標(biāo)準(zhǔn):①均行甲狀腺切除手術(shù),術(shù)后病理組織學(xué)證實為甲狀腺癌,符合相關(guān)診斷流程和標(biāo)準(zhǔn)[6];②術(shù)前未接受任何形式的治療;③臨床數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他部位惡性腫瘤或血液腫瘤;②發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移者;③既往頸部手術(shù)史,隨訪失聯(lián)。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 手術(shù)切除的癌組織以及癌旁經(jīng)病理學(xué)證實的正常組織(距腫瘤組織邊緣≥5 mm)新鮮標(biāo)本置入液氮中冷凍保存。取組織標(biāo)本室溫下復(fù)融,Prime Script miRNA cDNA合成試劑盒(日本TaKaRa公司)提取組織總RNA,Transcriptor First Strand cDNA Synthesis試劑盒(瑞士Roche公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL cDNA樣品,采用CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad公司)和SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(美國Bio-Rad公司)進行實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction,qRT-PCR),以β-actin為內(nèi)參,2-△△Ct計算CEACAM6、miR-146b、S100A6相對表達量。引物序列、反應(yīng)條件、反應(yīng)體系見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3隨訪 所有甲狀腺癌患者出院后電話或者門診等方式定期隨訪至2021年10月,隨訪期間患者腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡情況,計算總生存率,總生存時間定義為接受手術(shù)日期到因任何原因引起的死亡或隨訪結(jié)束時間。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.00統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料采用t檢驗和單因素方差分析。Kaplan-Meier繪制甲狀腺癌患者生存曲線,Log-Rank檢驗不同CEACAM6、miR-146b、S100A6表達下生存率的差異。單因素和多因素Cox比例風(fēng)險模型分析影響甲狀腺癌患者預(yù)后的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1癌組織和癌旁組織中CEACAM6、miR-146b、S100A6基因表達比較 癌組織CEACAM6、miR-146b、S100A6表達高于癌旁組織(P<0.05),見表2。

表2 癌組織和癌旁組織中CEACAM6、miR-146b、S100A6表達差異Table 2 Expression differences of CEACAM6, miR-146b and S100A6 in cancer tissues and adjacent tissues

2.2不同臨床病理特征 CEACAM6、miR-146b、S100A6表達比較腫瘤直徑>1 cm、低中度分化、T3～T4b期、N1a～N1b患者癌組織中CEACAM6、miR-146b、S100A6表達高于腫瘤直徑≤1 cm、高度分化、T1～T2期、N0患者(P<0.05),其他臨床病理特征間CEACAM6、miR-146b、S100A6表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 不同臨床病理特征CEACAM6、miR-146b、S100A6表達差異Table 3 Expression differences of CEACAM6, miR-146b and S100A6 in different clinicopathological features

2.3Kaplan-Meier生存分析 本次隨訪期間死亡16例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示CEACAM6高表達組、miR-146b高表達組、S100A6高表達組患者總生存率低于CEACAM6低表達組、miR-146b低表達組、S100A6低表達組(P<0.05),見表4,圖1。

表4 不同CEACAM6、miR-146b、S100A6表達甲狀腺癌患者生存率差異Table 4 Survival rate difference of thyroid cancer patients with different expressions of CEACAM6, miR-146b and S100A6 (例數(shù),%)

2.4Cox比例風(fēng)險模型分析預(yù)后的影響因素 以甲狀腺癌患者隨訪期間預(yù)后生存情況為因變量(死亡=1,存活=0),納入年齡(連續(xù)變量)、性別(男性=0,女性=1)、腫瘤大小(≤1 cm=0,>1 cm=1)、分化程度(高度分化=0,低中度分化=1)、T分期(T1～T2期=0,T3～T4b期=1)、N分期(N0=0,N1a～N1=1)、CEACAM6(低表達=0,高表達=1)、miR-146b低表達=0,高表達=1)、S100A6低表達=0,高表達=1)為自變量。多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析顯示N1a～N1b、CEACAM6高表達、miR-146b高表達、S100A6高表達是甲狀腺癌患者不良預(yù)后的危險因素(P<0.05),見表5。

圖1 不同CEACAM6、miR-146b、S100A6表達甲狀腺癌患者生存曲線圖

表5 影響甲狀腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Table 5 Multivariate Cox regression analysis of factors affecting prognosis of thyroid cancer patients

3 討 論

甲狀腺癌是發(fā)病率最高的頭頸部腫瘤以及臨床最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病原因和發(fā)病機制復(fù)雜多樣,確切病因尚難肯定,但是綜合流行學(xué)調(diào)查、腫瘤實驗性研究以及臨床觀察發(fā)現(xiàn)目前已知的有輻射污染、碘攝入過量或不足、甲狀腺疾病、肥胖、吸煙史、女性、基因突變、心理因素等等[7-8]。多數(shù)甲狀腺癌患者手術(shù)切除后可獲得長期的生存,但是術(shù)后易復(fù)發(fā),不同組織學(xué)類型甲狀腺癌預(yù)后差異較大,且目前缺乏對高侵襲性甲狀腺癌的有效治療手段[9],因此探尋甲狀腺癌發(fā)生的關(guān)鍵生物標(biāo)志物有助于預(yù)后評估,更好的指導(dǎo)臨床治療,改善患者預(yù)后。

CEACAM6是癌胚抗原家族中多功能、高度糖基化的細胞黏附蛋白,通常在上皮細胞表面和骨髓細胞表面表達,參與相鄰細胞間或細胞外基質(zhì)和細胞間黏附,在胚胎發(fā)生、神經(jīng)組織發(fā)育、炎癥、免疫細胞遷移和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10]。CEACAM6還可介導(dǎo)其他癌胚抗原家族成員間結(jié)合以及與整聯(lián)蛋白受體結(jié)合,調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo),其異常表達與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[11]?，F(xiàn)有研究[12]顯示CEACAM6過表達可激活蛋白激酶/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路促使透明細胞腎細胞癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,在喉鱗狀細胞癌中CEACAM6啟動子區(qū)域的DNA高甲基化,導(dǎo)致其表達下調(diào),且CEACAM6低表達與喉鱗狀細胞癌疾病進展有關(guān)[13],在口腔鱗狀細胞癌中,CEACAM6通過與表皮生長因子受體相互作用激活細胞內(nèi)信號級聯(lián)傳導(dǎo),促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CEACAM6在甲狀腺癌中表達明顯增高,且與甲狀腺癌大小、分化程度、T、N分期有關(guān),生存分析顯示CEACAM6高表達者生存率低于CEACAM6低表達者,Cox回歸分析顯示CEACAM6高表達是甲狀腺癌預(yù)后不良的危險因素,表明CEACAM6在甲狀腺癌中可能發(fā)揮致癌基因作用,CEACAM6過表達與甲狀腺癌發(fā)生進展有關(guān),CEACAM6可作為甲狀腺癌預(yù)后評估的潛在指標(biāo)。

miR-146b是一種多功能miRNA,可調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫和炎癥反應(yīng),還具有調(diào)節(jié)各種腫瘤細胞分化、增殖和遷移的作用,在結(jié)腸癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種人類癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制基因或癌基因作用[15]?，F(xiàn)有研究[16]顯示miR-146b通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路抑制前列腺癌自噬,增強其增殖和生長活力,miR-146b-3p在宮頸癌組織中上調(diào),通過直接靶向15-羥基前列腺素脫氫酶增強細胞增殖、遷移[17],miR-146b-5p還可誘導(dǎo)白色脂肪組織褐變并加速脂肪分解,減少脂肪量,導(dǎo)致惡病質(zhì)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146b在甲狀腺癌中表達上調(diào),且與甲狀癌增大、低中分化、TN晚分期以及低生存率有關(guān),表明miR-146b過表達可能促使甲狀腺癌進展。分析機制為miR-146b可靶向抑制其下游基因PTEN的表達,激活磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositol 3-kinase,PI3K)/AKT信號通路,促使甲狀腺癌細胞增殖[19]。

S100A6是一種鈣調(diào)蛋白,位于人類染色體1q21,可調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白動力學(xué),細胞增殖、分化,鈣代謝等,還參與PI3K/AKT、Wnt/β-連環(huán)蛋白、p38/絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB等多種信號通路調(diào)節(jié),與人類多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[20]。S100A6在宮頸癌細胞中表達升高,S100A6過表達通過激活PI3K/AKT信號通路,增加宮頸癌細胞的增殖和遷移[21],在結(jié)直腸癌中S100A6通過促使癌細胞中鈣周期蛋白結(jié)合蛋白Ca2+依賴性核易位,促使癌癥進展。本研究結(jié)果顯示S100A6在甲狀腺癌中表達上調(diào),S100A6過表達與甲狀腺癌惡性侵襲行為以及預(yù)后不良有關(guān)。分析原因為:PI3K/AKT信號通路在甲狀腺癌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,PI3K、AKT磷酸化在促進甲狀腺癌細胞增殖中起關(guān)鍵作用,S100A6過表達可激活PI3K/AKT信號通路,繼而促使甲狀腺癌細胞惡性增殖,導(dǎo)致腫瘤進展。

綜上所述,甲狀腺癌組織中CEACAM6、miR-146b、S100A6表達均增高,CEACAM6、miR-146b、S100A6高表達與甲狀腺癌體積增大、低中分化、晚T、N分期以及預(yù)后不良有關(guān),可作為甲狀腺癌的潛在指標(biāo)。本研究局限之處在于尚不能直接證實CEACAM6、miR-146b、S100A6在甲狀腺癌的致癌基因作用,尚待進一步開展基礎(chǔ)研究證實。