范語彤,白兆榮,張耀國(guó),李鵬飛,高俊玲,周洪霞*

(1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系,河北 唐山 063000;2.河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 唐山 063000)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是由于多種原因(如高血壓、動(dòng)靜脈血管畸形、腦淀粉樣變性、煙霧病等)誘發(fā)的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂出血的病理現(xiàn)象,占全部腦卒中患者總數(shù)的15%,患者1個(gè)月的病死率高達(dá)30%～50%,是導(dǎo)致我國(guó)居民殘疾和死亡的主要原因之一。雖然ICH在臨床上通過藥物或手術(shù)治療取得顯著進(jìn)展,但預(yù)后較差,易導(dǎo)致其他器官功能障礙,需要進(jìn)一步尋找治療腦出血的有效方法。近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自我繁殖力強(qiáng)、旁分泌、無免疫排異等生物特性備受關(guān)注,可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在療法。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)是MSCs中的一種,Han等[2]通過體內(nèi)外培養(yǎng)ADSCs發(fā)現(xiàn)其可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞及其他中胚層細(xì)胞,并擁有神經(jīng)形態(tài),其取材方便、分化能力均優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。這提示ADSCs可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想干細(xì)胞,有廣泛的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于ADSCs移植在ICH治療中的應(yīng)用和研究鮮少報(bào)道,其機(jī)制仍不清楚。ICH損傷的病理機(jī)制包括氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、炎癥反應(yīng)等,其中自噬是目前關(guān)注度較高的機(jī)制之一[3]。在ICH大鼠模型中,通過透射電鏡通可觀察到血腫周邊組織細(xì)胞中存在大量自噬小體結(jié)構(gòu),細(xì)胞自噬參與調(diào)控腦組織的損傷與凋亡[4]。He等[5]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血再灌注損傷大鼠,可通過抑制自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)而達(dá)到腦保護(hù)作用。ADSCs作為與骨髓來源的干細(xì)胞有著相似生物特性的中胚層細(xì)胞,自噬是否可成為ADSCs發(fā)揮作用的潛在治療靶點(diǎn)?因此,本實(shí)驗(yàn)將大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞作為治療細(xì)胞,通過右側(cè)紋狀體注射給腦出血模型,研究ADSCs移植對(duì)ICH大鼠治療作用并探討其對(duì)自噬的影響及可能作用機(jī)制,為臨床上治療腦出血提供新的治療靶點(diǎn)和方向。

1 材 料 與 方 法

1.1主要試劑與儀器 完全培養(yǎng)基12(dulbecco′s modified eagle media:nutrient mixture F-12,DMEM/F12)、Ⅳ型膠原酶均購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司;胰蛋白酶、青-鏈霉素購(gòu)自美國(guó)GIBCO BRL公司;異硫氰酸熒光素-黏附分子29(fluorescein isothiocyanate-adhesion molecular-29,FITC-CD29)抗體、異硫氰酸熒光素-黏附分子45(fluorescein isothiocyanate-adhesion molecular-45,FITC-CD45)抗體、異硫氰酸熒光素-黏附分子90(fluorescein isothiocyanate-adhesion molecular-90,FITC-CD90)抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司,LC3抗體、Beclin1抗體購(gòu)自日本MBL公司;PV-6000通用型二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物公司;蛋白質(zhì)定量試劑盒自聯(lián)科生物;p-AKT抗體、p-mTOR抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;山羊抗兔IgG HRP購(gòu)自Biosharp公司;鼠腦立體定位儀購(gòu)自美國(guó)Stoelting公司,微量進(jìn)樣器購(gòu)自上海醫(yī)學(xué)儀器廠,牙科鉆購(gòu)自深圳瑞沃德公司,OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、全自動(dòng)顯微鏡掃描系統(tǒng)均購(gòu)自日本Olympus公司,凝膠成像分析系統(tǒng)、生物分子成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad有限公司,透射電子顯微鏡購(gòu)自日本Hitachi公司,雙轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)(specific pathogen free,SPF)雄Sprague-Dawley大鼠220只,8～11周齡,體重(220+80) g,購(gòu)于北京阜康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)于在華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房飼養(yǎng),溫度22～25 ℃,濕度控制在(40±5)%,自由攝水?dāng)z食。適應(yīng)飼養(yǎng)7～10 d后,將其隨機(jī)分為3組:Sham組、ICH組和ADSCs組。

1.3方法

1.3.1大鼠ADSCs的分離與培養(yǎng) 隨機(jī)選取10只健康6～8周齡SD大鼠,通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)麻醉大鼠,斷頸處死后用75%酒精浸泡約5 min,無菌條件下,在超凈工作臺(tái)取大鼠腹股溝部周圍脂肪,將其表面附著的毛細(xì)血管剔除干凈后用含有2%雙抗的PBS沖洗三遍,加入1.5 mL完全培養(yǎng)基剪碎脂肪,直到組織變?yōu)橐后w狀,加入氨基酸和葡萄糖(dulbecco′s modified eagle media,DMEM)完全培養(yǎng)基,離心機(jī)1 500 r/min離心5 min,廢棄中間分離出的含各組DMEM的培養(yǎng)基,加入含有200 mg/L濃度的Ⅳ型膠原酶溶液,于37 ℃水浴箱中消化60 min,消化完成后,離心機(jī)1 000 r/min離心5 min,廢棄上清液,于細(xì)胞沉淀中加入DMEM完全培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中。放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞穩(wěn)定3 d后換液,細(xì)胞濃度鋪滿培養(yǎng)瓶底95%后進(jìn)行傳代。

1.3.2鑒定ADSCs免疫表型 收集第4代生長(zhǎng)良好的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,4 ℃保存?zhèn)溆?離心機(jī)1 000 r/min離心10 min,棄上清液,4支流式細(xì)胞管收集細(xì)胞,滴加磷酸鹽緩沖液(細(xì)胞密度為1×103個(gè)/μL),每支100 μL,其中3支分別滴加FITC標(biāo)記的兔抗大鼠CD29、CD45和CD90(稀釋倍數(shù)為1∶30)各10 μL(細(xì)胞密度1×103個(gè)/μL),另1支作為空白對(duì)照,4 ℃避光孵育40 min,再次離心機(jī)1 000 r/min離心5 min,廢棄上清液,磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的CD29、CD45和CD90陽性表達(dá)率。

1.3.3腦出血模型制備 制備ICH模型的大鼠需進(jìn)行術(shù)前8 h禁食、禁水6 h,ICH組和ADSCs組采用大鼠自體尾動(dòng)脈血注血法[6]。ICH組:大鼠稱重后,用3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射,麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上,從大鼠尾動(dòng)脈抽取55 μL自體血緩慢注入大鼠右側(cè)基底節(jié)(前囪后0.2 mm,旁開3.5 mm,深6 mm),以10 μL/min的速度注血,注射完成后留針5min后退針2 mm,再留針3 min,以1 mm/min的速度緩慢退針防止血液反流,隨后骨蠟密封,縫合頭皮,將大鼠放置恒溫室觀察至動(dòng)物蘇醒。Sham組按同樣的方法但不注入自體血。ADSCs組:ICH模型造模成功2 h后,于大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)域注射5 μL含有1×105個(gè)ADSCs,Sham組和ICH組相同位置給予同等劑量生理鹽水。

1.3.4大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 待術(shù)畢各組大鼠清醒后按照改良的Zea-Longa[7]由輕到重8級(jí)(0～7分)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分:大鼠無任何不對(duì)稱神經(jīng)缺損行為0分;提起尾倒掛時(shí)左前肢不能完全伸展為1分;于1分的基礎(chǔ)上左前肢活動(dòng)出現(xiàn)明顯障礙為2分;大鼠左前肢緊貼胸壁為3分;大鼠自由活動(dòng)行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為4分;行走時(shí)伴有明顯左前后爪后推動(dòng)作為5分;圍繞原地旋轉(zhuǎn)為6分;左側(cè)完全不能行走,躺向左側(cè)為7分。

1.3.5腦組織取材及病理觀察 在各組大鼠術(shù)后對(duì)應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn),將大鼠用3%戊巴比妥(0.2 mL/100 g)深度麻醉后,打開大鼠胸腔,于心臟主動(dòng)脈處先用至少40 mL的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)灌注后再用至少200 mL的4%多聚甲醛灌注20 min后剖取完整腦組織。于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h以上,用于以下實(shí)驗(yàn):蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)、尼氏染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3.6腦組織HE染色 制備好的石蠟切片脫蠟至水后,蘇木素染核1 min,90%鹽酸酒精分化8 s,自來水中返藍(lán)8 min后,伊紅染色30 s,經(jīng)乙醇低濃度到高濃度梯度迅速分化,再經(jīng)二甲苯透明、中性樹膠封片,常溫晾干后用顯微鏡觀察腦組織病理變化并采圖。

1.3.7腦組織尼氏染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后于37 ℃焦油紫染色液浸染1 h。由低濃度到高濃度梯度的乙醇迅速分化,后經(jīng)二甲苯脫水、中性樹膠封片,常溫晾干后用顯微鏡觀察未受損神經(jīng)元數(shù)量并采圖。

1.3.8腦組織含水量(brain water content,BWC)測(cè)定 將取得的前半部分立體定位注射周圍厚度為2 mm腦組織,用濾紙吸干腦組織表面的血液和水分,用電子分析天平稱出濕重記錄后放入恒溫箱內(nèi)100 ℃烘至恒重后測(cè)干重。按Elliott公式計(jì)算腦組織含水量(BWC%)=[(腦濕重-腦干重)/腦濕重]×100%。

1.3.9免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腦組織石蠟切片脫蠟至水,高壓鍋高壓抗原修復(fù)3 min充分暴露抗原決定簇后,加入3%內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑溫室封閉15 min,分別滴加稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育箱中孵育30 min,再滴加DAB顯色劑濕盒中避光顯色3～5 min,于顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒,純水終止反應(yīng),蘇木素復(fù)染核,經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯脫水、透明、干燥后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察、記錄并分析。分別測(cè)定LC3、Beclin1、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平。

1.3.10Western Blot檢測(cè) 每只稱取腦組織60～80 mg,少量液氮冷卻后使用組織研磨儀研磨至粉末狀,加入蛋白裂解液,離心后取上清,提取蛋白后用蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,上樣完電泳1 h,恒流220 mA,5%的封閉液搖床上封閉2 h,Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,加入Ⅱ抗孵育2 h后,用電化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescent,ECL)顯影后分析蛋白條帶灰度值。分別測(cè)定LC3、Beclin1、p-AKT、p-mTOR的蛋白表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)學(xué)檢查評(píng)分、腦組織未受損神經(jīng)元計(jì)數(shù)和腦組織水含量采用重復(fù)測(cè)量方差分析。應(yīng)用Graphad prism8.0和Image J繪制數(shù)據(jù)結(jié)果和圖片。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠ADSCs的鑒定 運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs表面標(biāo)記物,所培養(yǎng)的大鼠細(xì)胞中黏附分子CD29和CD90的陽性率分別為96.6%、96.7%,CD29、CD90呈陽性表達(dá),CD45的陽性率為0.37%,CD45呈陰性表達(dá)。結(jié)果提示培養(yǎng)的細(xì)胞符合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞純度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(圖1)。

圖1 ADSCs 表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果A.CD29;B.CD90;C.CD45Figure 1 Results of flow cytometry de-tection of surface markers of ADSCs

2.2ADSCs移植后可改善ICH大鼠神經(jīng)功能障礙 實(shí)驗(yàn)取各組術(shù)后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d對(duì)大鼠進(jìn)行Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分。Sham組大鼠在完全清醒后未出現(xiàn)行為學(xué)改變,反應(yīng)靈敏,與假手術(shù)組大鼠相比較,ICH組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高,于術(shù)后12 h逐漸升高,3 d達(dá)至高峰,之后逐漸下降(P<0.05);與ICH組相比較,ADSCs組對(duì)應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植可改善腦出血大鼠神經(jīng)功能障礙。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)學(xué)檢查評(píng)分比較Table 1 Comparison of neurological examination scores of rats at different time points 分)

2.3ADSCs移植可改善ICH大鼠腦損傷程度 光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組腦組織完整,細(xì)胞排列整齊、間質(zhì)無水腫、無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與Sham組比較,ICH組腦出血后第3天大鼠腦組織基底節(jié)周圍明顯占位效應(yīng),大鼠腦組織可見大量紅細(xì)胞,細(xì)胞間隙變大、水腫,炎細(xì)胞浸潤(rùn)及大量神經(jīng)細(xì)胞變性壞死,此現(xiàn)象至5 d后有所緩解。與模型組相比,ADSCs組對(duì)應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織病理癥狀均明顯減輕,較少的紅細(xì)胞,水腫減少以及較少的神經(jīng)細(xì)胞壞死(圖2)。結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植可改善腦出血大鼠腦損傷程度。

圖2 各組大鼠腦組織染色結(jié)果(HE染色)

2.4ADSCs移植治療ICH大鼠減少未受損神經(jīng)元數(shù)量 假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體形態(tài)完整,數(shù)量較多。與Sham組相比,ICH組神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,細(xì)胞皺縮,核碎裂,體積減小,12 h未受損的神經(jīng)元數(shù)量開始減少,至3 d時(shí)受損的神經(jīng)元數(shù)量達(dá)至高峰,5 d后逐漸增多,隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,對(duì)細(xì)胞核完整的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ICH組相比,ADSCs組相應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體數(shù)量明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)。結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血大鼠可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用見圖3,表2。

圖3 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞尼氏染色結(jié)果

表2 各組大鼠腦組織未受損神經(jīng)元計(jì)數(shù)Table 2 Counts of undamaged neurons in brain tissue of rats in each group 個(gè))

2.5ADSCs移植改善ICH大鼠腦組織水腫 Sham組大鼠術(shù)后腦組織7 d前各時(shí)間點(diǎn)幾乎無明顯的變化。ICH組12 h后腦組織水含量開始升高,至3 d達(dá)高峰,隨后降低,ADSCs組的腦組織含水量變化趨勢(shì)與ICH組基本一致,與Sham組相比,ICH組各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ICH組相比,ADSCs組各時(shí)間點(diǎn)腦組織水含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植可改善腦出血大鼠腦組織水腫情況,見表3。

表3 腦組織水含量變化Table 3 Changes of water content in brain tissue

2.6ADSCs移植抑制LC3、Beclin1陽性細(xì)胞表達(dá) 與Sham組相比,ICH組7 d內(nèi)LC3、Beclin1陽性細(xì)胞的表達(dá)顯著增多;與模型組相比,ADSCs組各時(shí)間點(diǎn)LC3、Beclin1陽性細(xì)胞的表達(dá)顏色較淺,數(shù)量明顯降低;免疫組化法下,LC3、Beclin1陽性表達(dá)為棕褐色,LC3、Beclin1陽性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平相符。ADSCs移植后自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的陽性表達(dá)明顯降低(圖4,5),提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可能抑制自噬的過度激活。

圖4 Beclin1在大鼠腦組織的表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

圖5 LC3在大鼠腦組織的表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

2.7ADSCs移植增加p-AKT、p-mTOR的陽性細(xì)胞表達(dá) 與Sham組相比,ICH組7 d內(nèi)p-AKT、p-mTOR陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯增加;與模型組相比,ADSCs組各時(shí)間點(diǎn)p-AKT、p-mTOR陽性細(xì)胞的表達(dá)顏色較深,數(shù)量明顯增多;免疫組織化學(xué)法下,p-AKT、p-mTOR陽性表達(dá)為棕褐色,p-AKT、p-mTOR陽性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平相符。ADSCs移植后腦出血大鼠腦組織內(nèi)p-AKT、p-mTOR陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖6,7)。結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)移植治療腦出血大鼠可能激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路。

圖6 p-AKT在大鼠腦組織的表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

圖7 p-mTOR在大鼠腦組織的表達(dá)結(jié)果(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

2.8ADSCs移植通過激活A(yù)KT/mTOR通路抑制ICH大鼠自噬活性 為了進(jìn)一步探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血的作用機(jī)制,本次實(shí)驗(yàn)用Western Blot檢測(cè)3組大鼠1 d、3 d腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1及自噬相關(guān)通路蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達(dá)情況。與Sham組相比,ICH組LC3、Beclin1的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與ICH組相比,ADSCs組LC3、Beclin1的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);ADSCs移植后腦出血大鼠腦組織內(nèi)LC3、Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖8,表4,5);與Sham組相比,ICH組AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05);與ICH組相比,ADSCs組AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯升高;ADSCs移植后腦出血大鼠腦組織內(nèi)AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(P<0.05);結(jié)果提示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路抑制自噬而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用(圖9,表6,7)。

圖8 免疫印跡法檢測(cè)LC3、Beclin1蛋白的表達(dá)結(jié)果

表4 免疫印跡法檢測(cè)各組LC3、Beclin1蛋白1 d的表達(dá)結(jié)果Table 4 Expression results of LC3 and Beclin1 proteins detected by Western blot in each group at 1 d

表5 免疫印跡法檢測(cè)各組LC3、Beclin1蛋白3 d的表達(dá)結(jié)果Table 5 Expression results of LC3 and Beclin1 proteins detected by Western Blot in each group at 3 d

圖9 免疫印跡法檢測(cè)AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白的表達(dá)結(jié)果

表6 免疫印跡法檢測(cè)各組AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白1 d的表達(dá)結(jié)果Table 6 The expression of phosphorylated protein of AKT/mTOR signaling pathway detected by Western Blot in each group at 1 d

表7 免疫印跡法檢測(cè)各組AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化蛋白3 d的表達(dá)結(jié)果Table 7 The expression of phosphorylated protein of AKT/ mTOR signaling pathway detected by Western blot in each group at 3 d

3 討 論

ICH的致殘率和致死率均較高,目前臨床上主要運(yùn)用手術(shù)和藥物治療方案,但腦出血患者預(yù)后極差,仍不可避免的長(zhǎng)期遭受由于血腫周圍繼發(fā)性損傷帶來的嚴(yán)重殘疾障礙,給其家庭和社會(huì)帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8]。因此進(jìn)一步研究ICH的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)安全有效的治療方案對(duì)于ICH患者至關(guān)重要。ICH后神經(jīng)損傷不可再生是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的主要原因之一[9],MSCs移植是目前再生醫(yī)學(xué)研究的熱門,MSCs多向分化潛能在一定條件下,可分化為多種組織細(xì)胞,一定程度上可修復(fù)受損的組織[10]。隨著對(duì)不同來源的MSCs研究的深入,因ADSCs來源豐富、取材方便且免疫排斥小等特點(diǎn),受到越來越多研究者們的青睞。人體脂肪中含有充足的ADSCs,每毫升脂劑中干細(xì)胞比骨髓中干細(xì)胞數(shù)高約8倍。即使老齡患者來源的ADSCs也具有取材方便且抗衰老能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]。ADSCs可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞及其他中胚層細(xì)胞,并擁有神經(jīng)形態(tài)[12]。Gómez-Pinedo等[13]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs移植腦卒中小鼠,修復(fù)受損腦組織內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌,促進(jìn)血管生成,從而恢復(fù)大鼠神經(jīng)功能?？梢?ADSCs有望成為治療ICH的良好種子,但目前關(guān)于ADSCs移植治療ICH的研究鮮少報(bào)道。為探究ADSCs移植對(duì)ICH后引起的繼發(fā)性損傷的影響,本實(shí)驗(yàn)采用右側(cè)紋狀體的注射方式將ADSCs移植到大鼠腦內(nèi),結(jié)果顯示與ICH組相比,ADSCs移植后的7 d內(nèi)明顯改善了ICH大鼠神經(jīng)功能障礙、減少神經(jīng)細(xì)胞的壞死以及減輕腦組織水腫情況。提示ADSCs移植有效改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能,但具體機(jī)制尚未完全明確。

腦出血的病理機(jī)制主要包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷,原發(fā)性腦損傷是腦出血后血腫對(duì)鄰近腦組織的占位效應(yīng)。繼發(fā)性腦損傷是在原發(fā)性腦損傷的基礎(chǔ)上引起周圍腦組織發(fā)生連鎖的病理生理反應(yīng)如炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬、脂質(zhì)過氧化等[14]。其中自噬過度激活會(huì)導(dǎo)致多種疾病繼發(fā)性損傷,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬活性可減輕ICH后引起的繼發(fā)性腦損傷[16]。因此,尋找有效的治療藥物抑制細(xì)胞自噬,對(duì)治療腦出血疾病有重要意義。Mazen等[17]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs移植對(duì)大鼠小腦損傷有一定修復(fù)作用。自噬的調(diào)節(jié)作為MSCs治療應(yīng)用中的潛在治療靶點(diǎn)[18]。為探究ADSCs移植是否通過抑制自噬活性減輕ICH后引起的繼發(fā)性損傷。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)和Western Blot法對(duì)自噬重要的蛋白標(biāo)記物L(fēng)C3和自噬啟動(dòng)的標(biāo)志Beclin1進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,與ICH組相比,ADSCs移植后,損傷的腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的表達(dá)及表達(dá)量明顯降低,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化能力被降低,抑制了自噬水平,提示ADSCs移植治療ICH改善大鼠神經(jīng)功能的障礙、減少神經(jīng)細(xì)胞的壞死以及減輕腦組織水腫情況與抑制自噬活性有關(guān)。如何實(shí)現(xiàn)自噬抑制需要進(jìn)一步探討。

近年來,AKT/mTOR信號(hào)通路在腦出血中的作用成為研究熱點(diǎn),在細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬以及生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮著重要的作用[19]。該通路已被證實(shí)在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮了最直接的調(diào)控作用[20],該通路中mTOR即是大分子底物復(fù)合物,又是哺乳動(dòng)物中雷帕霉素的分子靶標(biāo)如ULJ1、atg13等因子。mTOR的活化可對(duì)自噬產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用,磷酸化的AKT可激活mTOR,mTOR將ULK1激酶充分激活后會(huì)抑制下游分子ULK1復(fù)合物從而有效抑制自噬。在神經(jīng)疾病動(dòng)物模型中通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路能減少神經(jīng)元損傷、促進(jìn)新生血管生成等[21-22]。Yan等[23]研究發(fā)現(xiàn)加巴噴丁通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬和活性氧的水平,進(jìn)而對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Xu等[24]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路減少細(xì)胞凋亡,改善二氯化二丁基錫誘導(dǎo)的慢性胰腺炎。在本研究中,ADSCs移植后,Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與ICH模型組相比,腦組織中AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)增加,LC3、Beclin1的蛋白表達(dá)隨之降低,與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。提示ADSCs移植治療ICH可能激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞自噬,發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)性作用。

綜上所述,ICH后及時(shí)進(jìn)行ADSCs的移植對(duì)修復(fù)出血周圍繼發(fā)性腦組織損傷,恢復(fù)神經(jīng)功能有積極的促進(jìn)作用,也為臨床治療腦出血提供新的方向和治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中ADSCs移植后未進(jìn)行透射電鏡觀察自噬小體的變化,且ADSCs移植治療ICH的具體作用機(jī)制尚不能完全明確以及缺少移植后進(jìn)行長(zhǎng)期療效的研究。ADSCs在體內(nèi)分化機(jī)制、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)等良好的生物特性,其最佳的移植時(shí)間窗、治療劑量及植入途徑等都需作進(jìn)一步的研究和探索。