李煥君，王曉鳳，王莉莉，康 倩，張曉燦，劉曉蓮，馬寧寧

（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

葉酸是一種廣泛存在于綠色蔬菜水果中的B族維生素。葉酸是多數(shù)生物體內(nèi)碳單位的供體，是氨基酸、核酸及泛酸等生物合成所必需的物質(zhì)。人體特別是孕婦體內(nèi)缺乏葉酸則會(huì)引起氨基酸合成減少進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的疾病，例如嬰兒的巨幼細(xì)胞性貧血、神經(jīng)管缺陷、心血管疾病等癥。動(dòng)物體內(nèi)缺少葉酸時(shí)，則發(fā)生食欲減退，生長(zhǎng)受阻，羽毛發(fā)育不良等。

N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸是以對(duì)硝基苯甲酸為起始原料，先經(jīng)酰氯化反應(yīng)制得對(duì)硝基苯甲酰氯，然后與谷氨酸鈉經(jīng)縮合反應(yīng)制得N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸，最后經(jīng)還原反應(yīng)制得N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸。N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸和2,4,5-三氨基-6- 羥基嘧啶、三氯丙酮生成葉酸粗品，葉酸粗品經(jīng)過(guò)二次酸溶、堿溶得到葉酸濕成品，最后對(duì)濕成品進(jìn)行干燥、混合、包裝。

N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸是合成葉酸的重要中間體，作為河北冀衡藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)葉酸的主要原料對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量要求較高，對(duì)硝基苯甲酸、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸雜質(zhì)含量過(guò)高會(huì)直接影響N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸的質(zhì)量，在生產(chǎn)過(guò)程中也會(huì)傳遞到葉酸產(chǎn)品中，將會(huì)影響葉酸安全性和有效性，因此需要控制該產(chǎn)品的雜質(zhì)含量，來(lái)提高葉酸產(chǎn)品的質(zhì)量。本方法的建立能夠更好地控制原料藥葉酸使用的N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸的質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)用分析儀器及試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器：分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司，型號(hào)QUINIX124-1CN），高效液相色譜儀（Waters Arc-2489），Milli-Q IQ 7000超純水儀（德國(guó)默克密理博），KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

主要試劑：甲醇（色譜純），廠家：默克；N-對(duì)氨基苯甲酰-L- 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：EDQM 法定標(biāo)準(zhǔn)品；對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)硝基苯甲酸、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。

1.2 色譜條件

色譜柱：十八辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（AcclaimTM120 C18，5 μm 150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液∶甲醇=80∶20；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.2 mL/min；柱溫：40 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 方法的專屬性研究

2.1.1 溶液配制

（1） 對(duì)氨基苯甲酸溶液：稱取對(duì)氨基苯甲酸約10 mg 于100 mL 容量瓶中，加入5 mL 28.6 g/L碳酸鈉溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

（2） 對(duì)硝基苯甲酸溶液：稱取對(duì)硝基苯甲酸約10 mg 于100 mL 容量瓶，加入5 mL 28.6 g/L 碳酸鈉溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

（3） N- 對(duì)硝基苯甲酰-L- 谷氨酸溶液：稱取N- 對(duì)硝基苯甲酰-L- 谷氨約10 mg 于100 mL容量瓶中，加入5 mL 28.6 g/L 碳酸鈉溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

（4） N- 對(duì)氨基苯甲酰-L- 谷氨酸溶液（氨一）：稱?。ò币唬?對(duì)照品約10 mg 于50 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 28.6 g/L 碳酸鈉溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度。

2.1.2 操作步驟

氨一與各雜質(zhì)的混合溶液：稱取N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸（氨一） 對(duì)照品約10 mg 于50 mL容量瓶中，加入2.5 mL28.6 g/L 碳酸鈉溶解，加入對(duì)氨基苯甲酸溶液、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸溶液、對(duì)硝基苯甲酸溶液，加流動(dòng)相稀釋至刻度。分別精密上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀。

2.1.3 方法專屬性結(jié)果

方法專屬性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 方法專屬性結(jié)果Table 1 Methods exclusivity results

由表1 可得，混合溶液中與N-對(duì)氨基苯甲酰-L- 谷氨酸主峰相鄰的雜質(zhì)峰的分離度分別為2.72、4.82，均＞1.5，符合規(guī)定，各雜質(zhì)分離效果良好。

N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸與各雜質(zhì)對(duì)照品的分離度圖譜如圖1 所示。

圖1 N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸與各雜質(zhì)對(duì)照品的分離度圖譜Fig.1 Resolution profile of N-p-aminobenzoyl-L-glutamate from each impurity control

2.2 方法的線性

2.2.1 對(duì)氨基苯甲酸的線性及范圍

精密稱取對(duì)氨基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加樣品稀釋劑溶解并稀釋成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL 的6 個(gè)不同濃度的對(duì)氨基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并依次編號(hào)。取上述各濃度的溶液20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖并計(jì)算峰面積。得出的數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)氨基苯甲酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)氨基苯甲酸的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 對(duì)氨基苯甲酸的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship of aminbenzoic acid

由圖2 可得，在0.010 09 ～0.605 4 μg/mL 的線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，線性方程為：y=282 95x+12.835。

2.2.2 對(duì)硝基苯甲酸的線性及范圍

精密稱取對(duì)硝基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加樣品稀釋劑溶解并稀釋成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL 的6 個(gè)不同濃度的對(duì)硝基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并依次編號(hào)。取上述各濃度的溶液20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖并計(jì)算峰面積。得出的數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)硝基苯甲酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)硝基苯甲酸的線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 對(duì)硝基苯甲酸的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship for pair-nitrobenzoic acid

由圖3 可得，在0.025 ～0.600 0 μg/mL 的線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1，線性方程為：y=21 361x+182.01。

2.2.3 N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸的線性及范圍

在N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸定量限濃度至限度的150%范圍內(nèi)，精密稱取N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加樣品稀釋劑溶解并稀釋成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL 的6個(gè)不同濃度的N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并依次編號(hào)。取上述各濃度的溶液20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖并計(jì)算峰面積。得出的數(shù)據(jù)以峰面積為縱坐標(biāo)，以N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4 所示。

圖4 N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸的線性關(guān)系Fig.4 N-Lineity of p-nitrobenzoyl-L-glutamate

由圖4 可得，在0.027 027 ～0.600 6 μg/mL 的線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，線性方程為：y=12 578x-77.804。

2.3 加標(biāo)精密度的測(cè)定

2.3.1 供試品溶液

精密度稱取同一批次6 份N- 對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸樣品各10.0 mg 分別于不同的50 mL 容量瓶中，加入2.5 mL28.6 g/L 碳酸鈉溶解，加入定量限濃度的對(duì)硝基苯甲酸、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸以流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液

精密稱取N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸對(duì)照品10 mg、對(duì)氨基苯甲酸對(duì)照品10 mg 至同一個(gè)50 mL容量瓶中，加入5.0 mL28.6 g/L 碳酸鈉溶解，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取2.5 ～10 mL 容量瓶中，流動(dòng)相定容，搖勻。

2.3.3 測(cè)定

分別吸取溶劑、系統(tǒng)適用性溶液、樣品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，運(yùn)行時(shí)間為N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸主峰保留時(shí)間的5 倍。雜質(zhì)對(duì)氨基苯甲酸的檢測(cè)數(shù)據(jù)分別為0.19%、0.19%、0.20%、0.19%、0.20%、0.18%，計(jì)算RSD 為3.93%；雜質(zhì)對(duì)硝基苯甲酸的檢測(cè)數(shù)據(jù)為0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%，計(jì)算RSD為0；雜質(zhì)N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸的檢測(cè)數(shù)據(jù)為0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%，計(jì)算RSD 為0，6 份樣品溶液重復(fù)性較好，方法的精密度較高。

2.4 樣品溶液的檢測(cè)

2.4.1 供試品溶液

分別稱取3 批樣品10 mg 于不同的50 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 28.6 g/L 碳酸鈉溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4.2 測(cè)定

分別吸取溶劑、系統(tǒng)適用性、供試品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，運(yùn)行時(shí)間為N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸主峰保留時(shí)間的5 倍。

不同批次樣品對(duì)氨基苯甲酸的檢測(cè)結(jié)果為0.05%、0.06%、0.05%，對(duì)硝基苯甲酸、N- 對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸雜質(zhì)均未檢出，得到的樣品峰形較好，樣品溶液雜質(zhì)濃度在線性范圍內(nèi)。該方法適于N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸中對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)硝基苯甲酸、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸雜質(zhì)的檢測(cè)。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文所建立的液相色譜法定量分析N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸中對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)硝基苯甲酸、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸雜質(zhì)，具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)小，誤差小等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果表明，N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸與對(duì)氨基苯甲酸分離度為4.82，對(duì)氨基苯甲酸在濃度0.010 09 ～0.605 4 μg/mL 具有良好的線性，r=0.999 7，線性方程：y=28 295x+12.835；對(duì)硝基苯甲酸在濃度0.025 ～0.600 0 μg/mL 具有良好的線性，r=0.999 0，線性方程：y=21 361x+182.01；N- 對(duì)硝基苯甲酰-L- 谷氨酸在濃度0.027 027 ～0.600 6 μg/mL 具有良好的線性，r=0.999 8， 線性方程：y= 12 578x-77.804，樣品溶液雜質(zhì)濃度在線性范圍內(nèi)，6 個(gè)樣品的重復(fù)性較好，因而該方法可以作為N-對(duì)氨基苯甲酰-L-谷氨酸中，對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)硝基苯甲酸、N-對(duì)硝基苯甲酰-L-谷氨酸雜質(zhì)的定量檢測(cè)。