胡榕 馬英姿 劉思思 陳景震 肖志紅 李昌珠

摘要 為明確無患子皂苷對甜菜夜蛾的控制作用，本試驗分別用添加無患子皂苷（0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/g）的混毒飼料喂養(yǎng)甜菜夜蛾 2齡幼蟲，測定甜菜夜蛾幼蟲存活率、幼蟲發(fā)育歷期、蛹重、化蛹率、卵孵化率、性比等指標。采用液相色譜-質譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）分析無患子皂苷中的主要化學成分。結果表明，喂飼后72 h，取食4 mg/g混皂苷飼料的甜菜夜蛾幼蟲開始死亡，其幼蟲存活率隨皂苷濃度的升高而降低;相比空白對照組，取食4 mg/g混皂苷飼料的幼蟲，其幼蟲期延長8.55 d（P＜0.05），蛹重降低了41.13%（P＜0.05），化蛹率下降46.43%（P＜0.05）。取食0.5 mg/g以及2 mg/g混皂苷飼料的幼蟲其卵孵化率分別比空白對照降低9.61%、16.12%;取食混有皂苷的飼料會擾亂甜菜夜蛾的性比，其中混入2 mg/g皂苷的處理對其性比影響最大，雌性比為25.00%。從無患子皂苷中鑒定出10種皂苷類化合物，共鑒別出6種常春藤型三萜皂苷，3種齊墩果酸型三萜皂苷，1種大戟烷型三萜皂苷。

關鍵詞 甜菜夜蛾;?生長發(fā)育;?繁殖;?無患子皂苷;?化學成分

中圖分類號： S 433.4

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021730

Abstract In order to clarify the control effect of Sapindus saponin on Spodoptera exigua， the 2nd instar larvae of S.exigua were fed with the feed mixed with seven different concentrations （0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8 and 16 mg/g） of Sapindus saponin. The larval survival rate， larval developmental duration， pupal weight， pupation rate， egg hatching rate and sex ratio of S.exigua were measured. The main chemical components of Sapindus saponin were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）. The results showed that the death of larvae began to appear at 72 h after feeding with 4 mg/g saponin and the survival rate of larvae decreased with increasing concentration of saponin. The larval stage prolonged by 8.55 d; the pupal weight was significantly decreased by 41.13%， and the pupation rate was significantly decreased by 46.43 compared with the control group. The egg hatching rate decreased by 9.61% and 16.12%， respectively， compared with the control group when fed with 0.5 mg/g or 2 mg/g saponin. The moth sex ratio was biased by feeding saponin， and 2 mg/g saponin had the greatest impact on the sex ratio， with a female to male ratio of 25.00%. Ten saponins were identified from Sapindus， including six ivy-type triterpenoid saponins， three oleanolic acid-type triterpene saponins， and one euphorbia-type triterpene saponin.

Key words Spodoptera exigua;?growth and development;?reproduction;?Sapindus saponin;?chemical composition

甜菜夜蛾Spodoptera exigua （Hübner）是一種世界范圍內的重要農業(yè)害蟲［1］，威脅許多經濟作物，如棉花、玉米、煙草等的生產，造成經濟損失。其通過遷徙越冬而不滯育。在過去的20年里，化學殺蟲劑是控制該害蟲最有效的手段，包括一些傳統(tǒng)的有機磷、擬除蟲菊酯和苯甲酰脲類殺蟲劑［2］，但隨著這類化學殺蟲劑長期的不合理使用，甜菜夜蛾已對一些藥劑產生了高度抗性，且引發(fā)了農藥殘留以及環(huán)境污染等一系列問題［3］。因而，尋求一種無污染的生物防治方法已經成為全世界的重點研究課題之一。植物源殺蟲劑具有低毒、低殘留、選擇范圍大、可延緩害蟲抗藥性、開發(fā)污染小等特點［4-5］，近年來得到廣泛關注。

無患子Sapindus saponaria為無患子科Sapindaceae無患子屬Sapindus落葉喬木，又名木患子、肥皂樹、洗手果等，主要生長在東南亞各國以及我國的長江流域，分布于淮河以南各地［6-7］，無患子是一種綜合利用價值較高的經濟樹種，其假種皮中含有大量皂苷成分。目前有關無患子皂苷抗菌、抗腫瘤、保護心腦血管及肝臟、殺蟲等方面的研究已有一些報道［8］。據(jù)報道無患子皂苷對小管福壽螺Pomacea canaliculata、斜紋夜蛾 Spodoptera litura、弧金翅夜蛾Thysanoplusia orichalcea等均有較好的抑制作用［9-11］。鑒此，本文研究了無患子皂苷提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的影響，旨在為將無患子皂苷開發(fā)成低毒、高效的植物源農藥提供理論依據(jù)和科學指導。

1?材料與方法

1.1?材料

供試無患子采于湖南省瀏陽市普跡鎮(zhèn)。甜菜夜蛾幼蟲及人工飼料均購買自科云生物技術有限公司，幼蟲使用人工飼料飼養(yǎng)，成蟲用5%蜂蜜水飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（26±2）℃，相對濕度（70±2）%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2?方法

1.2.1?無患子皂苷提取液的制備

無患子皂苷的提取方法主要包括水提法或有機溶劑提取法。水提法的提取率較高，且成本較低，適用于農業(yè)生產。因此本試驗采用水提法提取，具體操作參照方譯晨［12］的方法。無患子果皮中的三萜皂苷主要是齊墩果酸型，因此本試驗以齊墩果酸標準品作為對照［13］。齊墩果酸標準品購自索萊寶生物科技有限公司。以齊墩果酸標準溶液質量濃度為橫坐標（x）、吸光度值為縱坐標（y），得到標準曲線y=0.672 5x+0.050 1，R2=0.999 6。采用紫外-可見分光光度計測定無患子皂苷含量［14］。

1.2.2?無患子皂苷對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的影響

參照李秀梅等［15］的飼料混毒法。將無患子皂苷提取液用蒸餾水稀釋成1、2、4、8、16、32、64 mg/mL的試驗濃度，取5 mL藥液與20 g人工飼料充分混勻，配制成含0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/g無患子皂苷的混毒人工飼料，并設蒸餾水為空白對照。在24孔養(yǎng)蟲板中加入混毒飼料，每孔分別接入1頭生長狀態(tài)良好，大小一致的甜菜夜蛾2齡幼蟲，在溫度（26±2）℃，相對濕度（70±2）%， 光周期L∥D=14 h∥10 h的智能人工氣候箱中飼養(yǎng)，每個濃度處理20頭，3次重復。人工飼料保持新鮮，以確保幼蟲正常生長［16］。每隔24 h清除糞便及殘留垃圾，統(tǒng)計幼蟲死亡率、化蛹率、幼蟲歷期等數(shù)據(jù)，記錄至幼蟲全部死亡或化蛹為止［17］，幼蟲化蛹后稱量蛹重。幼蟲死亡的判定標準為輕觸試蟲蟲體，蟲體不能自主運動者視為死亡。待蛹羽化后，記錄羽化的雌雄成蟲數(shù)量。挑選１雌１雄進行配對（共10對），放入成蟲飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng)，盒中放入浸潤10％蜂蜜水的脫脂棉球供成蟲補充營養(yǎng)（每天補充清水保持棉球濕潤）。每天定時觀察記錄盒內壁雌蟲的產卵情況以及卵的孵化情況［18］。

1.3?化學成分分析

無患子皂苷的化學組分采用 HPLC-MS法分析和鑒定。色譜柱：沃特世ACQUITY UPLC HSS T3 （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm）;流動相A：0.1%甲酸水溶液;流動相B：0.1%甲酸乙腈;柱溫：50℃;進樣量：3 μL;梯度洗脫：起始時95%A，5%B; 10 min 時70%A，30%B; 32 min時40%A，60%B;37 min時5%A，95%B;38 min時95%A%， 5%B;流速：0.3 mL/min;檢測波長：254 nm。MS條件如下：UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時間液質聯(lián)用儀：正負離子掃描模式;掃描范圍：100～1 500 m/z;霧化氣（GS1）：50 psi;霧化氣（GS2）：50 psi;氣簾氣（CUR）：35 psi;離子源溫度（TEM）：600℃（正）和550℃（負）;離子源電壓（IS）： 5 500 V（正）和-4 500 V（負）;一級掃描：去簇電壓（DP）：100 V;聚焦電壓（CE）：10 V;二級掃描：使用TOF MS-Product Ion-IDA模式采集質譜數(shù)據(jù)，CID能量為±40 V和±20 V，進樣前，用CDS泵做質量軸校正，使質量軸誤差小于2 mg/kg。各峰經質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，標準圖譜庫Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫，確定無患子皂苷中的化合物結構。

1.4?數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

化蛹率=化蛹蟲數(shù)/試驗總蟲數(shù)×100%［19］;

羽化率=羽化蟲數(shù)/化蛹蟲數(shù)×100%［19］。

試驗數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 26.0軟件處理。存活率、羽化率、化蛹率，性比和卵孵化率等百分比數(shù)據(jù)首先進行反正弦平方根轉換。不同無患子皂苷處理下甜菜夜蛾適合度參數(shù)用Kolmogorov-Smirnov測驗進行正態(tài)分布檢驗。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)通過Kruskal-Wallis測驗（α=0.05）進行比較。正態(tài)分布數(shù)據(jù)通過單因素方差分析（One-way ANOVA） 進行分析（α=0.05），平均數(shù)采用LSD法進行多重比較［20］。

2?結果與分析

2.1?無患子皂苷對甜菜夜蛾發(fā)育以及性比的影響

由表1可知，無患子皂苷對甜菜夜蛾的幼蟲存活率、化蛹率、羽化率、卵孵化率以及雌性比均存在不同程度的影響，其中對甜菜夜蛾幼蟲存活率以及化蛹率影響較大，對甜菜夜蛾的羽化率、卵孵化率以及雌性比影響較小。藥后72 h，當添加的皂苷濃度達到4 mg/g及以上時幼蟲出現(xiàn)死亡，且無患子皂苷濃度越高，幼蟲存活率越低。與空白對照組相比，添加4 mg/g皂苷時，化蛹率降低46.43%（P＜0.05）;取食0.25 mg/g和1 mg/g混皂苷飼料后羽化率分別降低18.06%和11.43%;取食0.5 mg/g以及2 mg/g混皂苷飼料后卵孵化率分別降低9.61%、16.12%。取食混有無患子皂苷的飼料會擾亂甜菜夜蛾的雌性比，其中取食混有2 mg/g皂苷的處理其雌性比明顯降低，為25.00%。

2.2?無患子皂苷對甜菜夜蛾幼蟲期和蛹期的影響

無患子皂苷對甜菜夜蛾幼蟲期有顯著影響，混皂苷飼料中無患子皂苷濃度越高，對幼蟲發(fā)育的抑制作用越明顯（表2）。4 mg/g混皂苷飼料處理下的幼蟲期（17.57 d）比空白對照組延長8.55 d（P＜0.05）。無患子皂苷對甜菜夜蛾蛹期有一定程度的影響，但蛹期與無患子皂苷濃度沒有明顯相關性，其中0.5 mg/g混皂苷飼料處理下的蛹期最長，與空白組相比，蛹期延長2.97 d。

2.3?無患子皂苷對甜菜夜蛾蛹重的影響

無患子皂苷對甜菜夜蛾蛹重有顯著影響（圖1），且濃度越高抑制作用越顯著?；旌?.5～4 mg/g皂苷處理組的蛹重均顯著低于空白對照，其中混4 mg/g皂苷飼料處理下的蛹重最小，為0.120 1 g，相比空白組減輕了0.083 9 g。0.25、0.5、1、2 mg/g混皂苷處理甜菜夜蛾的蛹重比空白對照組依次減輕0.011 7、0.035 8、0.047 0、0.077 0 g。

2.4?無患子皂苷成分分析

無患子皂苷提取物其化學成分見表3。結合高分辨質譜結果擬合分子式，在 Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫中檢索，對無患子果皮中皂苷類成分進行快速篩查和鑒別，共鑒別出10種皂苷類物質，含有五環(huán)三萜皂苷類齊墩果烷型皂苷、四環(huán)三萜類大戟烷型皂苷。不同種類的無患子皂苷的主要區(qū)別在于其骨架結構、糖的種類、連接順序和連接位置等不同，其中糖的種類主要為葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等。根據(jù)常春藤型皂苷元m/z（471/393），齊墩果酸m/z（455/407）等特征碎片離子［21］，對無患子果皮中該類成分進行快速篩查和鑒別，共鑒別出6種常春藤型三萜皂苷，3種齊墩果酸型三萜皂苷，1種大戟烷型三萜皂苷。

3?結論與討論

一般來說，植物源殺蟲劑不會直接殺死害蟲，但會使害蟲在接觸殺蟲劑后產生拒食反應，停止取食或顯著減少取食量，導致其不能蛻皮進入到下一齡期，幼蟲處于瀕臨死亡狀態(tài)，最后部分害蟲死亡［22］。本試驗結果表明，無患子皂苷對甜菜夜蛾的生長發(fā)育及繁殖的抑制作用是多方面的，主要包括直接“殺死”害蟲、顯著抑制幼蟲蛻皮、降低害蟲蛹重、延長害蟲幼蟲期和蛹期等方面，以此來控制害蟲群體增長速度和種群數(shù)量。甜菜夜蛾幼蟲取食不同濃度無患子皂苷提取物后，其幼蟲期延長，可能是因為皂苷提取液使甜菜夜蛾產生拒食現(xiàn)象，導致食物攝入不足，沒有足夠營養(yǎng)支撐而無法進入下一個蛻皮階段［23］；或因取食皂苷提取物后其消化系統(tǒng)受損，影響營養(yǎng)物質的正常吸收；或因有毒化合物破壞了甜菜夜蛾體內激素平衡，導致其產生畸形蟲態(tài)［24］。本研究有個別幼蟲取食無患子皂苷提取液后出現(xiàn)延遲蛻皮，遲遲不能進入下一階段的情況，推測是幼蟲體內激素水平失衡，導致幼蟲活力降低，出現(xiàn)畸形蟲，相關作用機制有待進一步研究。

植物提取液對昆蟲繁殖力有一定的抑制作用，這在當歸和蓖麻乙醇提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的亞致死效應的研究中已有報道［24］。本研究中出現(xiàn)部分卵不能正常孵化以及個別雌蟲所產卵全部不能孵化的情況。推測可能是因為無患子皂苷通過影響昆蟲的內分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及昆蟲體內相關酶系，致使成蟲性腺發(fā)育成熟能力下降，生殖能力減退。具體表現(xiàn)為雄蟲不易產生精子或精子形成后失去活力，雌蟲產卵量下降或所產卵多為未受精的無效卵。

有多項研究證實皂苷類物質具有抗蟲活性。如錄麗平等［25］研究發(fā)現(xiàn)無患子中的皂苷對小菜蛾Plutella xylostella （Linnaeus）和果蠅Drosophila具有毒殺活性。Huang等［9］從無患子水提物中分離出的常春藤型三萜皂苷Mukurozi-saponin G、Mukurozi-saponin E1對福壽螺具有顯著的殺螺活性，致死率高達70%～100%。另外，Upadhyay等［26］也指出無患子提取物可以抑制椎實螺Lymnaea acuminata神經組織中的乙酰膽堿酯酶（AchE）、酸性和堿性磷酸酶（ACP/ALP），從而使螺死亡。因此，三萜皂苷是無患子果皮中具有極大利用價值的一類皂苷，可以在農業(yè)生產中進一步開發(fā)利用。

本研究利用液相色譜-質譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）從無患子皂苷提取物中鑒定到大量的三萜皂苷和倍半萜皂苷，由此推測無患子皂苷中抑制甜菜夜蛾生長發(fā)育及繁殖的活性物質可能是無患子皂苷中的三萜類化合物或者是倍半萜類化合物。具體是哪種成分或者哪幾種成分協(xié)同作用，以及以哪種方式起作用，作用機理等還有待進一步深入探究。進一步研究無患子皂苷對農田害蟲的生物活性并對其活性成分進行分離純化及鑒定，對合成和開發(fā)新型植物源農藥和對指導無公害蔬菜生產都有重要意義。

參考文獻

［1］?ZHENG Xialin， WANG Pan， CHENG Wenjie， et al. Projecting overwintering regions of the beet armyworm， Spodoptera exigua in China using the CLIMEX model ［J/OL］. Journal of Insect Science， 2012， 12：13. DOI： 10.1673/031.012.1301.

［2］?GONG Changwei， YAO Xinge， YANG Qunfang， et al. Fitness costs of chlorantraniliprole resistance related to the SeNPF overexpression in the Spodoptera exigua （Lepidoptera： Noctuidae） ［J/OL］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（9）： 5027. DOI： 10.3390/ijms22095027.

［3］?劉向陽， 朱福興， 張凱. 甜菜夜蛾抗藥性研究現(xiàn)狀［J］.昆蟲知識， 2007（5）：632-636.

［4］?程禹銘. 不同寄主植物對甜菜夜蛾生長發(fā)育的影響及甜菜夜蛾寄主選擇的化學機制［D］. 揚州： 揚州大學， 2015.

［5］?萬年峰， 陳曉勤， 季香云， 等. 當歸和蓖麻乙醇提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的亞致死效應［J］. 中國生態(tài)農業(yè)學報， 2013， 21（9）： 1135-1141.

［6］?徐圓圓， 周思維， 陳仲， 等. 無患子不同器官中的總皂苷和總黃酮含量［J］. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版）， 2021， 45（4）： 83-89.

［7］?魏鳳玉， 余錦城， 解輝， 等. 天然無患子皂苷的提取分離［J］. 安徽化工， 2007（3）： 15-17.

［8］?徐圓圓， 賈黎明， 陳仲， 等. 無患子三萜皂苷研究進展［J］. 化學通報， 2018， 81（12）： 1078-1088.

［9］?HUANG Huichi， LIAO Sinchung， CHANG Fangrong， et al. Molluscicidal saponins from Sapindus mukorossi， inhibitory agents of golden apple snails， Pomacea canaliculata ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（17）： 4916-4919.

［10］SAHA S， WALIA S， KUMAR J， et al. Screening for feeding deterrent and insect growth regulatory activity of triterpenic saponins from Diploknema butyracea and Sapindus mukorossi ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58 （1）： 434-440.

［11］EDDAYA T， BOUGHDAD A， SIBILLE E， et al. Biological activity of Sapindus mukorossi Gaerten （Sapindaceae） aqueous extract against Thysanoplusia orichalcea （Lepidoptera： Noctuidae） ［J］. Industrial Crops & Products， 2013， 50： 325-332.

［12］方譯晨. 無患子皂苷提取液與螯合劑聯(lián)合作用修復鎘污染土壤的研究［D］. 南寧： 廣西大學， 2019.

［13］解輝. 無患子皂苷分離純化的研究［D］.合肥： 合肥工業(yè)大學， 2008.

［14］張翠. 無患子總皂苷制備工藝研究［D］.無錫： 江南大學， 2012.

［15］李秀梅， 方繼朝. 18種中草藥提取物對褐飛虱和甜菜夜蛾的殺蟲活性分析［J］. 昆蟲學報， 2010， 53（3）： 298-306.

［16］丁金鳳， 徐春梅， 張正群， 等. 溴氰蟲酰胺對雙委夜蛾生長發(fā)育、繁殖和營養(yǎng)利用的影響［J］. 中國農業(yè)科學， 2017， 50（22）： 4307-4315.

［17］賴添財. 甜菜夜蛾和斜紋夜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性風險評估［D］. 南京： 南京農業(yè)大學， 2011.

［18］魯智慧， 和淑琪， 嚴乃勝， 等. 溫度對草地貪夜蛾生長發(fā)育及繁殖的影響［J］. 植物保護， 2019， 45（5）： 27-31.

［19］劉瑤. 云南地區(qū)蘇云金芽胞桿菌的分離鑒定和對幾種鱗翅目害蟲生長發(fā)育的影響［D］. 雅安： 四川農業(yè)大學， 2016.

［20］李棟， 李曉維， 馬琳， 等. 溫度對番茄潛葉蛾生長發(fā)育和繁殖的影響［J］. 昆蟲學報， 2019， 62（12）： 1417-1426.

［21］張權， 齊夢蝶， 康瑩， 等. UHPLC-LTQ Orbitrap MS快速鑒別無患子果皮中部分苷及苷元成分［J］. 質譜學報， 2018， 39（2）： 224-239.

［22］蔣春先， 熊忠梅， 李慶， 等. 用吳茱萸乙醇提取物對斜紋夜蛾的生物活性進行研究［J］. 西南大學學報（自然科學版）， 2008（2）： 105-108.

［23］孫孌姿， 王佺珍， 呼天明， 等. 菊苣葉提取物對粘蟲的生物活性研究［J］. 草業(yè)學報， 2011， 20（2）： 60-66.

［24］萬年峰， 陳曉勤， 季香云， 等. 當歸和蓖麻乙醇提取液對甜菜夜蛾生長發(fā)育和繁殖的亞致死效應［J］. 中國生態(tài)農業(yè)學報， 2013， 21（9）： 1135-1141.

［25］錄麗平， 孫長德， 楊美林， 等. 無患子皂苷粗提物殺蟲活性研究［J］. 安徽農業(yè)科學， 2010， 38（2）： 10755-10756.

［26］UPADHYAY A， SINGH D K. Inhibition kinetics of certain enzymes in the nervous tissue of vector snail Lymnaea acuminata by active molluscicidal components of Sapindus mukorossi and Terminalia chebula ［J］. Chemosphere， 2011， 85（6）： 1095-1100.

（責任編輯：楊明麗）