郭子晗　譚德冠　黃東益　付莉莉　孫雪飄　張家明

關(guān)鍵詞：橡膠樹；愈傷組織；乳管細(xì)胞分化；茉莉酸甲酯；基因表達(dá)

中圖分類號：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）屬于大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，在我國主要分布于海南、云南、廣東等熱帶北緣地區(qū)[1]。乳管是橡膠樹膠乳生物合成和貯存的唯一場所，是由無數(shù)個乳管細(xì)胞所組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)器官[2-3]。橡膠樹樹皮被定期開割，樹皮中被割開的乳管中會排出奶汁狀的膠乳（細(xì)胞質(zhì)），膠乳經(jīng)收集和加工后，成為重要的工業(yè)原料——天然橡膠（順-1，4-聚異戊二烯）。世界上99%的商品天然橡膠來源于橡膠樹[4]。

由于樹皮中乳管的數(shù)量是決定天然橡膠產(chǎn)量的最重要因素[5-6]，為此許多學(xué)者聚焦于橡膠樹乳管分化研究。大部分學(xué)者用大田植株枝條或樹干的樹皮作為研究對象，通過外界物理或化學(xué)刺激來研究樹皮乳管分化情況[7-9]。近期有學(xué)者以橡膠樹愈傷組織為研究對象，通過在培養(yǎng)基中添加化學(xué)物質(zhì)來研究愈傷乳管分化情況[10]。

茉莉酸（JA）具有促進(jìn)橡膠樹乳管分化功能的這一發(fā)現(xiàn)是橡膠樹乳管分化研究中取得的突破性進(jìn)展。最初HAO 等[7]發(fā)現(xiàn)外源JA 能促進(jìn)橡膠樹枝條樹皮乳管分化；TAN 等[10]也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加一定濃度的外源JA 能促進(jìn)橡膠樹愈傷組織中乳管細(xì)胞分化。當(dāng)前，科研人員圍繞JA 調(diào)控橡膠樹乳管分化的信號分子開展一系列研究并取得一定進(jìn)展。HbSKP1、HbCOI1、HbJA1、HbLAP1、HblMYC1、HblMYC2、HbEREBP1 等與茉莉酸信號途徑相關(guān)的基因被克隆出來[11-14]；發(fā)現(xiàn)橡膠樹乳管細(xì)胞存在特定的茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊COI1-JAZ3-MYC2，其通過上調(diào)法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因和小橡膠粒子蛋白（SRPP）基因的表達(dá)來增強(qiáng)橡膠生物合成[15]。

茉莉酸甲酯（MeJA）與JA 同屬茉莉酸類物質(zhì)（JAs），但MeJA 對橡膠樹愈傷乳管細(xì)胞分化的效果尚不清楚。本研究將應(yīng)用橡膠樹愈傷組織來系統(tǒng)研究MeJA 對乳管細(xì)胞分化的效果，并研究其所調(diào)控橡膠合成相關(guān)基因表達(dá)情況，對促進(jìn)橡膠樹愈傷組織在乳管分化研究中的應(yīng)用，以及開發(fā)新型橡膠樹增產(chǎn)刺激劑從而促進(jìn)橡膠樹天然橡膠的生產(chǎn)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于2021 年3 月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場三隊(duì)采集橡膠樹品種‘熱研7-33-97的春花，將采集好的花枝立刻置于4℃冰箱中保存24～48 h，備用。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹花藥愈傷組織的誘導(dǎo) 選取已低溫處理過的處于單核期的橡膠樹雄花，包裹于紗布中，于75%（V/V）酒精中浸泡30 s，然后置于0.15%（W/V）升汞中浸泡8 min，無菌水清洗5遍。于無菌條件下從雄花中剝離出雄蕊，接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。

誘導(dǎo)花藥愈傷組織培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[16]，具體為改良MS+2，4-D 1 mg/L+ KT 1 mg/L+NAA1 mg/L+8%（W/V）蔗糖+2.5 g/L Phytagel。為了研究MeJA 對花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的效果，在誘導(dǎo)花藥愈傷組織培養(yǎng)基中分別添加0、1、2、3 mg/L 的MeJA。上述的植物激素和Phytagel均購自Sigma 公司。培養(yǎng)基pH 為6.2，培養(yǎng)條件為25℃黑暗條件。

1.2.2 橡膠樹花藥愈傷組織鮮重測量 取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織塊于電子天平中稱重，每個處理重復(fù)20 次。

1.2.3 組織化學(xué)法鑒定愈傷組織乳管細(xì)胞 組織化學(xué)法參照田維敏等[17]的方法進(jìn)行。取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織于70%（V/V）酒精中固定48 h，酒精系列脫水，冰醋酸過渡處理4 h，于60℃下溴-碘染色液處理48 h。冰醋酸浸洗3 次，每次2 h；無水酒精脫水3 次，每次1 h；正丁醇透明3 次，每次2 h。材料被滲蠟、包埋后，經(jīng)萊卡滑走切片機(jī)切成10 μm 厚的薄片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、固綠染色、無水酒精脫水、二甲苯透明處理后，再用中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的切片。

1.2.4 愈傷組織乳管細(xì)胞分化頻率 光學(xué)顯微鏡下觀察不同MeJA 濃度處理的花藥愈傷組織的組織化學(xué)切片，每處理隨機(jī)觀察30 個視野，統(tǒng)計(jì)每個視野中乳管細(xì)胞的分化頻率。愈傷組織乳管細(xì)胞分化頻率=（乳管細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量）×100%。

1.2.5 熒光定量PCR 分別取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織，采用北京天根生化科技有限公司的RNAprep Pure 植物總RNA提取試劑盒（產(chǎn)品號：DP432）提取愈傷組織RNA，再用Thermo Scientific 公司的RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（產(chǎn)品號：#K1622）將愈傷組織總RNA 反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。根據(jù)TANG 等[18]報(bào)道的調(diào)控橡膠樹橡膠生物合成的重要基因序列信息，選取與橡膠合成密切相關(guān)的小橡膠粒子蛋白（small rubber particleprotein，SRPP）基因的4 個家族成員（HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7）、橡膠延伸因子（rubber elongation factor， REF）基因的家族成員HbREF1、橡膠轉(zhuǎn)移酶（cis-Prenyl transferase，CPT）基因的家族成員HbCPT6 的序列設(shè)計(jì)引物（表1），用于熒光定量PCR 反應(yīng)。以在橡膠樹膠乳中穩(wěn)定表達(dá)的eIf2 基因[19]作為參考基因。利用寶生物公司的SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒（產(chǎn)品號：RR820A）進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，反應(yīng)共進(jìn)行40 個循環(huán)。每處理含有3 個生物學(xué)重復(fù)。采用2?ΔΔCT 法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.2.6 電鏡制片 電鏡超薄制片參考照田維敏等[17]的方法進(jìn)行。取培養(yǎng)至第65 天的1 mg/L MeJA 處理的愈傷組織置于預(yù)冷的4%戊二醛溶液中4℃下固定24 h，0.2 mol/L PBS 緩沖液清洗2 次，2%鋨酸4℃下再固定10 h，乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷滲透，環(huán)氧樹脂包埋，切成50～70 nm 薄片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡（HT-7700）下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA 對橡膠樹花藥愈傷組織生長的影響

在誘導(dǎo)橡膠樹花藥愈傷組織培養(yǎng)基中添加不同濃度MeJA，會明顯影響到愈傷組織塊的生長。培養(yǎng)至65 d 時，各處理的愈傷組織均呈現(xiàn)鮮黃色，表面凹凸不平（圖1A～圖1D）。MeJA 濃度為1 mg/L 的處理其愈傷塊平均鮮重（FW）為0.23 g，雖然略低于對照（0.24 g），但統(tǒng)計(jì)學(xué)上二者無顯著差異，說明MeJA 在0～1 mg/L 范圍內(nèi)對愈傷組織的生長影響不明顯。MeJA 濃度為2、3 mg/L的處理愈傷塊平均FW 分別為0.18 g 和0.13 g，均顯著低于對照和1 mg/L MeJA 的處理（圖1E），說明MeJA 在2～3 mg/L 范圍內(nèi)會抑制愈傷組織生長。對MeJA 濃度與愈傷FW 進(jìn)行相關(guān)性分析（圖1F），相關(guān)系數(shù)R 為-0.971，表明二者負(fù)相關(guān)，說明隨著培養(yǎng)基中MeJA 濃度的增加，抑制花藥愈傷組織生長的程度會加大，愈傷組織FW 呈現(xiàn)下降趨勢。上述結(jié)果表明低濃度的MeJA（0～1 mg/L）對花藥愈傷組織的影響不明顯，而高濃度的MeJA（2～3 mg/L）會抑制愈傷組織生長，且MeJA 濃度與愈傷組織生長呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.2 MeJA 對橡膠樹花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的影響

溴-碘染色法是一種經(jīng)典可靠的鑒別乳管細(xì)胞方法[20]。溴-碘染色的石蠟制片顯示培養(yǎng)至65 d的花藥愈傷組織中存在被染成棕色的細(xì)胞，是由于該細(xì)胞中的橡膠內(nèi)含物被溴-碘溶液染成棕色，這些細(xì)胞為乳管細(xì)胞（圖2A～圖2D）。切片中還存在一些黑褐色單寧細(xì)胞，該類細(xì)胞的單寧內(nèi)含物被染成黑褐色。此外，愈傷組織中還存在一些淀粉細(xì)胞，這些細(xì)胞內(nèi)充滿顆粒狀的淀粉粒。

培養(yǎng)基中添加一定濃度的MeJA 會促進(jìn)橡膠樹花藥愈傷乳管細(xì)胞分化。當(dāng)培養(yǎng)基中MeJA 濃度為1 mg/L 時，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率上升至15.8%，顯著高于其他處理，比對照（5.7%）增加近2 倍（圖2A、圖2B、圖2E）。當(dāng)培養(yǎng)基中MeJA 濃度為2 mg/L 時，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率為13.0%，雖然顯著高于對照，但卻顯著低于1 mg/L MeJA 的處理（圖2C、圖2E）。當(dāng)培養(yǎng)基中MeJA 濃度為3 mg/L 時，愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率下降至9.7%，雖然也顯著高于對照，但顯著低于1、2 mg/L MeJA 的處理（圖2D、圖2E）。上述結(jié)果說明培養(yǎng)基中添加低濃度的MeJA 能促進(jìn)愈傷組織乳管細(xì)胞分化，而高濃度的MeJA 會抑制其分化，其中MeJA 濃度為1 mg/L 效果最佳。

2.3 膠乳合成相關(guān)基因在MeJA 處理的花藥愈傷組織中表達(dá)分析

SRPP、REF、CPT 是存在于小橡膠粒子膜的蛋白質(zhì)，是參與橡膠生物合成的重要酶和調(diào)控因子，它們所編碼的基因在乳管細(xì)胞中特異表達(dá)[21-24]。筆者檢測橡膠樹SRPP、REF、CPT 基因在MeJA 處理的花藥愈傷組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它們表達(dá)量的變化趨勢與愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率的變化趨勢基本一致。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與對照相比，培養(yǎng)基中添加1～3 mg/L MeJA 后均能顯著促進(jìn)HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7、HbREF1、HbCPT6 的表達(dá)（圖3）。這是由于添加MeJA 后愈傷組織中乳管細(xì)胞數(shù)量增加所致。當(dāng)培養(yǎng)基中添加1mg/L MeJA 時愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率最高，此時HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7、HbREF1、HbCPT6 表達(dá)量最高，分別為對照的7.8、676.6、222.3、130.7、26.1、13.0 倍。當(dāng)培養(yǎng)基中添加2、3 mg/LMeJA 時愈傷乳管細(xì)胞發(fā)生頻率呈下降趨勢，此時除了HbSRPP7 外，其他基因表達(dá)量均隨著MeJA 濃度的升高而下降。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MeJA 能促進(jìn)橡膠樹愈傷組織中乳管細(xì)胞分化。

2.4 橡膠樹花藥愈傷乳管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

雖然通過溴-碘染色法能確切證實(shí)愈傷組織中存在乳管細(xì)胞，但愈傷乳管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)尚不清楚。橡膠樹樹皮乳管細(xì)胞的大尺寸橡膠粒子直徑為0.40～0.75 μm，中等尺寸橡膠粒子直徑為0.25～0.35 μm， 小尺寸橡膠粒子直徑為0.08～0.20 μm[21]。本研究采用透射電鏡技術(shù)來研究花藥愈傷組織中乳管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)愈傷乳管細(xì)胞中也存在大、中、小尺寸橡膠粒子，其中大尺寸橡膠粒子直徑為0.20～0.30 μm，中等尺寸粒子直徑為0.10～0.18 μm，小尺寸粒子直徑為0.04～0.08 μm（圖4）。與樹皮乳管細(xì)胞的橡膠粒子相比較，這些愈傷乳管細(xì)胞的橡膠粒子尺寸均較小，其原因可能是它們都處于發(fā)育早期，也可能是由于乳管細(xì)胞來源不同所致。愈傷乳管細(xì)胞內(nèi)還含有黃色體，它們呈球形囊泡狀，內(nèi)部含高電子致密物質(zhì)（圖4B）。

3 討論

已有研究表明JAs 具有能夠調(diào)節(jié)植物抗逆和抗病蟲害的防御反應(yīng)，同時還具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的功能[25-26]。橡膠樹乳管細(xì)胞中的膠乳主要起防御功能[27-28]，除了含有橡膠烴外，還含有一些有毒物質(zhì)，如羥基腈水解酶，用來催化腈基類化合物水解，釋放氫氰酸，抵御害蟲和病原菌的侵害[29]。在本研究中，培養(yǎng)基中添加MeJA 具有促進(jìn)橡膠樹花藥愈傷組織中乳管細(xì)胞分化的功能；而隨著愈傷組織中乳管細(xì)胞數(shù)量增加，所含的膠乳也會增多，因此愈傷組織中含有毒物質(zhì)的濃度可能會增高，這些有毒物質(zhì)可能會抑制愈傷組織生長，這可能是MeJA 影響愈傷組織生長的主要原因。

在本研究中，培養(yǎng)基中MeJA 濃度為1 mg/L時為橡膠樹花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的最佳濃度。而TAN 等[10]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中JA 濃度為2 mg/L時為橡膠樹花藥愈傷組織乳管細(xì)胞分化的最佳濃度。但在本研究中高濃度MeJA 處理其愈傷乳管細(xì)胞分化的變化趨勢與TAN 等[10]報(bào)道的相一致。這些結(jié)果表明MeJA 與JA 誘導(dǎo)愈傷乳管細(xì)胞分化的最佳濃度雖存在一定差異，但二者調(diào)控愈傷組織乳管細(xì)胞分化的效果相似，說明MeJA 可代替JA 進(jìn)行乳管細(xì)胞分化研究。

MeJA 與JA 同屬茉莉酸類物質(zhì)（JAs），但二者市場價格差異巨大，前者價格低廉，根據(jù)Sigma公司網(wǎng)站的報(bào)價，后者價格約為前者的140 倍（https：//www.sigmaaldrich.cn/CN/zh）。由于JA 價格過于昂貴，限制其在橡膠樹大田生產(chǎn)試驗(yàn)與應(yīng)用。JA 應(yīng)用于橡膠樹乳管分化的研究主要集中于枝條樹皮，發(fā)現(xiàn)JA 能促進(jìn)枝條樹皮分化次生乳管[7-8]。于俊紅等[9]開展了JA 對成齡橡膠樹次生乳管分化的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)JA 對成齡橡膠樹次生乳管分化具有促進(jìn)效果，但它們僅涂1 g 含1% JA的羊毛脂于面積2 cm×2 cm 的用刀片輕刮至綠色的橡膠樹皮層，1 個月后取處理部位樹皮進(jìn)行組織化學(xué)鑒定。目前尚未能像橡膠樹增產(chǎn)刺激劑乙烯利那樣涂抹于成齡橡膠樹割口處來開展JA 能否促進(jìn)橡膠樹增產(chǎn)的大田實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，MeJA 能促進(jìn)愈傷組織乳管細(xì)胞分化，表明其可代替JA 進(jìn)行乳管細(xì)胞分化研究。因此，在橡膠樹的大田生產(chǎn)試驗(yàn)中，將來可用價格低廉的MeJA來代替價格昂貴的JA 進(jìn)行，這對開發(fā)新型橡膠樹增產(chǎn)刺激劑，促進(jìn)橡膠樹生產(chǎn)具有一定意義。