郭子晗　譚德冠　黃東益　付莉莉　孫雪飄　張家明

關鍵詞：橡膠樹；愈傷組織；乳管細胞分化；茉莉酸甲酯；基因表達

中圖分類號：S794.1 文獻標識碼：A

橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）屬于大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經濟作物，在我國主要分布于海南、云南、廣東等熱帶北緣地區(qū)[1]。乳管是橡膠樹膠乳生物合成和貯存的唯一場所，是由無數個乳管細胞所組成的網狀結構器官[2-3]。橡膠樹樹皮被定期開割，樹皮中被割開的乳管中會排出奶汁狀的膠乳（細胞質），膠乳經收集和加工后，成為重要的工業(yè)原料——天然橡膠（順-1，4-聚異戊二烯）。世界上99%的商品天然橡膠來源于橡膠樹[4]。

由于樹皮中乳管的數量是決定天然橡膠產量的最重要因素[5-6]，為此許多學者聚焦于橡膠樹乳管分化研究。大部分學者用大田植株枝條或樹干的樹皮作為研究對象，通過外界物理或化學刺激來研究樹皮乳管分化情況[7-9]。近期有學者以橡膠樹愈傷組織為研究對象，通過在培養(yǎng)基中添加化學物質來研究愈傷乳管分化情況[10]。

茉莉酸（JA）具有促進橡膠樹乳管分化功能的這一發(fā)現(xiàn)是橡膠樹乳管分化研究中取得的突破性進展。最初HAO 等[7]發(fā)現(xiàn)外源JA 能促進橡膠樹枝條樹皮乳管分化；TAN 等[10]也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加一定濃度的外源JA 能促進橡膠樹愈傷組織中乳管細胞分化。當前，科研人員圍繞JA 調控橡膠樹乳管分化的信號分子開展一系列研究并取得一定進展。HbSKP1、HbCOI1、HbJA1、HbLAP1、HblMYC1、HblMYC2、HbEREBP1 等與茉莉酸信號途徑相關的基因被克隆出來[11-14]；發(fā)現(xiàn)橡膠樹乳管細胞存在特定的茉莉酸信號轉導模塊COI1-JAZ3-MYC2，其通過上調法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因和小橡膠粒子蛋白（SRPP）基因的表達來增強橡膠生物合成[15]。

茉莉酸甲酯（MeJA）與JA 同屬茉莉酸類物質（JAs），但MeJA 對橡膠樹愈傷乳管細胞分化的效果尚不清楚。本研究將應用橡膠樹愈傷組織來系統(tǒng)研究MeJA 對乳管細胞分化的效果，并研究其所調控橡膠合成相關基因表達情況，對促進橡膠樹愈傷組織在乳管分化研究中的應用，以及開發(fā)新型橡膠樹增產刺激劑從而促進橡膠樹天然橡膠的生產具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于2021 年3 月在中國熱帶農業(yè)科學院試驗農場三隊采集橡膠樹品種‘熱研7-33-97的春花，將采集好的花枝立刻置于4℃冰箱中保存24～48 h，備用。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹花藥愈傷組織的誘導 選取已低溫處理過的處于單核期的橡膠樹雄花，包裹于紗布中，于75%（V/V）酒精中浸泡30 s，然后置于0.15%（W/V）升汞中浸泡8 min，無菌水清洗5遍。于無菌條件下從雄花中剝離出雄蕊，接種于相應的培養(yǎng)基中。

誘導花藥愈傷組織培養(yǎng)基配方參考文獻[16]，具體為改良MS+2，4-D 1 mg/L+ KT 1 mg/L+NAA1 mg/L+8%（W/V）蔗糖+2.5 g/L Phytagel。為了研究MeJA 對花藥愈傷組織乳管細胞分化的效果，在誘導花藥愈傷組織培養(yǎng)基中分別添加0、1、2、3 mg/L 的MeJA。上述的植物激素和Phytagel均購自Sigma 公司。培養(yǎng)基pH 為6.2，培養(yǎng)條件為25℃黑暗條件。

1.2.2 橡膠樹花藥愈傷組織鮮重測量 取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織塊于電子天平中稱重，每個處理重復20 次。

1.2.3 組織化學法鑒定愈傷組織乳管細胞 組織化學法參照田維敏等[17]的方法進行。取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織于70%（V/V）酒精中固定48 h，酒精系列脫水，冰醋酸過渡處理4 h，于60℃下溴-碘染色液處理48 h。冰醋酸浸洗3 次，每次2 h；無水酒精脫水3 次，每次1 h；正丁醇透明3 次，每次2 h。材料被滲蠟、包埋后，經萊卡滑走切片機切成10 μm 厚的薄片。切片經二甲苯脫蠟、固綠染色、無水酒精脫水、二甲苯透明處理后，再用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察制備好的切片。

1.2.4 愈傷組織乳管細胞分化頻率 光學顯微鏡下觀察不同MeJA 濃度處理的花藥愈傷組織的組織化學切片，每處理隨機觀察30 個視野，統(tǒng)計每個視野中乳管細胞的分化頻率。愈傷組織乳管細胞分化頻率=（乳管細胞數量/總細胞數量）×100%。

1.2.5 熒光定量PCR 分別取培養(yǎng)至第65 天的不同MeJA 濃度處理的愈傷組織，采用北京天根生化科技有限公司的RNAprep Pure 植物總RNA提取試劑盒（產品號：DP432）提取愈傷組織RNA，再用Thermo Scientific 公司的RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（產品號：#K1622）將愈傷組織總RNA 反轉錄為第一鏈cDNA。根據TANG 等[18]報道的調控橡膠樹橡膠生物合成的重要基因序列信息，選取與橡膠合成密切相關的小橡膠粒子蛋白（small rubber particleprotein，SRPP）基因的4 個家族成員（HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7）、橡膠延伸因子（rubber elongation factor， REF）基因的家族成員HbREF1、橡膠轉移酶（cis-Prenyl transferase，CPT）基因的家族成員HbCPT6 的序列設計引物（表1），用于熒光定量PCR 反應。以在橡膠樹膠乳中穩(wěn)定表達的eIf2 基因[19]作為參考基因。利用寶生物公司的SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒（產品號：RR820A）進行熒光定量PCR 反應，反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，反應共進行40 個循環(huán)。每處理含有3 個生物學重復。采用2?ΔΔCT 法計算基因相對表達量。

1.2.6 電鏡制片 電鏡超薄制片參考照田維敏等[17]的方法進行。取培養(yǎng)至第65 天的1 mg/L MeJA 處理的愈傷組織置于預冷的4%戊二醛溶液中4℃下固定24 h，0.2 mol/L PBS 緩沖液清洗2 次，2%鋨酸4℃下再固定10 h，乙醇系列脫水，環(huán)氧丙烷滲透，環(huán)氧樹脂包埋，切成50～70 nm 薄片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡（HT-7700）下觀察。

2 結果與分析

2.1 MeJA 對橡膠樹花藥愈傷組織生長的影響

在誘導橡膠樹花藥愈傷組織培養(yǎng)基中添加不同濃度MeJA，會明顯影響到愈傷組織塊的生長。培養(yǎng)至65 d 時，各處理的愈傷組織均呈現(xiàn)鮮黃色，表面凹凸不平（圖1A～圖1D）。MeJA 濃度為1 mg/L 的處理其愈傷塊平均鮮重（FW）為0.23 g，雖然略低于對照（0.24 g），但統(tǒng)計學上二者無顯著差異，說明MeJA 在0～1 mg/L 范圍內對愈傷組織的生長影響不明顯。MeJA 濃度為2、3 mg/L的處理愈傷塊平均FW 分別為0.18 g 和0.13 g，均顯著低于對照和1 mg/L MeJA 的處理（圖1E），說明MeJA 在2～3 mg/L 范圍內會抑制愈傷組織生長。對MeJA 濃度與愈傷FW 進行相關性分析（圖1F），相關系數R 為-0.971，表明二者負相關，說明隨著培養(yǎng)基中MeJA 濃度的增加，抑制花藥愈傷組織生長的程度會加大，愈傷組織FW 呈現(xiàn)下降趨勢。上述結果表明低濃度的MeJA（0～1 mg/L）對花藥愈傷組織的影響不明顯，而高濃度的MeJA（2～3 mg/L）會抑制愈傷組織生長，且MeJA 濃度與愈傷組織生長呈負相關關系。

2.2 MeJA 對橡膠樹花藥愈傷組織乳管細胞分化的影響

溴-碘染色法是一種經典可靠的鑒別乳管細胞方法[20]。溴-碘染色的石蠟制片顯示培養(yǎng)至65 d的花藥愈傷組織中存在被染成棕色的細胞，是由于該細胞中的橡膠內含物被溴-碘溶液染成棕色，這些細胞為乳管細胞（圖2A～圖2D）。切片中還存在一些黑褐色單寧細胞，該類細胞的單寧內含物被染成黑褐色。此外，愈傷組織中還存在一些淀粉細胞，這些細胞內充滿顆粒狀的淀粉粒。

培養(yǎng)基中添加一定濃度的MeJA 會促進橡膠樹花藥愈傷乳管細胞分化。當培養(yǎng)基中MeJA 濃度為1 mg/L 時，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率上升至15.8%，顯著高于其他處理，比對照（5.7%）增加近2 倍（圖2A、圖2B、圖2E）。當培養(yǎng)基中MeJA 濃度為2 mg/L 時，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率為13.0%，雖然顯著高于對照，但卻顯著低于1 mg/L MeJA 的處理（圖2C、圖2E）。當培養(yǎng)基中MeJA 濃度為3 mg/L 時，愈傷乳管細胞發(fā)生頻率下降至9.7%，雖然也顯著高于對照，但顯著低于1、2 mg/L MeJA 的處理（圖2D、圖2E）。上述結果說明培養(yǎng)基中添加低濃度的MeJA 能促進愈傷組織乳管細胞分化，而高濃度的MeJA 會抑制其分化，其中MeJA 濃度為1 mg/L 效果最佳。

2.3 膠乳合成相關基因在MeJA 處理的花藥愈傷組織中表達分析

SRPP、REF、CPT 是存在于小橡膠粒子膜的蛋白質，是參與橡膠生物合成的重要酶和調控因子，它們所編碼的基因在乳管細胞中特異表達[21-24]。筆者檢測橡膠樹SRPP、REF、CPT 基因在MeJA 處理的花藥愈傷組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)它們表達量的變化趨勢與愈傷乳管細胞發(fā)生頻率的變化趨勢基本一致。熒光定量PCR 結果顯示，與對照相比，培養(yǎng)基中添加1～3 mg/L MeJA 后均能顯著促進HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7、HbREF1、HbCPT6 的表達（圖3）。這是由于添加MeJA 后愈傷組織中乳管細胞數量增加所致。當培養(yǎng)基中添加1mg/L MeJA 時愈傷乳管細胞發(fā)生頻率最高，此時HbSRPP1、HbSRPP2、HbSRPP6、HbSRPP7、HbREF1、HbCPT6 表達量最高，分別為對照的7.8、676.6、222.3、130.7、26.1、13.0 倍。當培養(yǎng)基中添加2、3 mg/LMeJA 時愈傷乳管細胞發(fā)生頻率呈下降趨勢，此時除了HbSRPP7 外，其他基因表達量均隨著MeJA 濃度的升高而下降。這些結果進一步證實MeJA 能促進橡膠樹愈傷組織中乳管細胞分化。

2.4 橡膠樹花藥愈傷乳管細胞的超微結構

雖然通過溴-碘染色法能確切證實愈傷組織中存在乳管細胞，但愈傷乳管細胞的超微結構尚不清楚。橡膠樹樹皮乳管細胞的大尺寸橡膠粒子直徑為0.40～0.75 μm，中等尺寸橡膠粒子直徑為0.25～0.35 μm， 小尺寸橡膠粒子直徑為0.08～0.20 μm[21]。本研究采用透射電鏡技術來研究花藥愈傷組織中乳管細胞的超微結構，發(fā)現(xiàn)愈傷乳管細胞中也存在大、中、小尺寸橡膠粒子，其中大尺寸橡膠粒子直徑為0.20～0.30 μm，中等尺寸粒子直徑為0.10～0.18 μm，小尺寸粒子直徑為0.04～0.08 μm（圖4）。與樹皮乳管細胞的橡膠粒子相比較，這些愈傷乳管細胞的橡膠粒子尺寸均較小，其原因可能是它們都處于發(fā)育早期，也可能是由于乳管細胞來源不同所致。愈傷乳管細胞內還含有黃色體，它們呈球形囊泡狀，內部含高電子致密物質（圖4B）。

3 討論

已有研究表明JAs 具有能夠調節(jié)植物抗逆和抗病蟲害的防御反應，同時還具有調節(jié)植物生長發(fā)育的功能[25-26]。橡膠樹乳管細胞中的膠乳主要起防御功能[27-28]，除了含有橡膠烴外，還含有一些有毒物質，如羥基腈水解酶，用來催化腈基類化合物水解，釋放氫氰酸，抵御害蟲和病原菌的侵害[29]。在本研究中，培養(yǎng)基中添加MeJA 具有促進橡膠樹花藥愈傷組織中乳管細胞分化的功能；而隨著愈傷組織中乳管細胞數量增加，所含的膠乳也會增多，因此愈傷組織中含有毒物質的濃度可能會增高，這些有毒物質可能會抑制愈傷組織生長，這可能是MeJA 影響愈傷組織生長的主要原因。

在本研究中，培養(yǎng)基中MeJA 濃度為1 mg/L時為橡膠樹花藥愈傷組織乳管細胞分化的最佳濃度。而TAN 等[10]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中JA 濃度為2 mg/L時為橡膠樹花藥愈傷組織乳管細胞分化的最佳濃度。但在本研究中高濃度MeJA 處理其愈傷乳管細胞分化的變化趨勢與TAN 等[10]報道的相一致。這些結果表明MeJA 與JA 誘導愈傷乳管細胞分化的最佳濃度雖存在一定差異，但二者調控愈傷組織乳管細胞分化的效果相似，說明MeJA 可代替JA 進行乳管細胞分化研究。

MeJA 與JA 同屬茉莉酸類物質（JAs），但二者市場價格差異巨大，前者價格低廉，根據Sigma公司網站的報價，后者價格約為前者的140 倍（https：//www.sigmaaldrich.cn/CN/zh）。由于JA 價格過于昂貴，限制其在橡膠樹大田生產試驗與應用。JA 應用于橡膠樹乳管分化的研究主要集中于枝條樹皮，發(fā)現(xiàn)JA 能促進枝條樹皮分化次生乳管[7-8]。于俊紅等[9]開展了JA 對成齡橡膠樹次生乳管分化的實驗，發(fā)現(xiàn)JA 對成齡橡膠樹次生乳管分化具有促進效果，但它們僅涂1 g 含1% JA的羊毛脂于面積2 cm×2 cm 的用刀片輕刮至綠色的橡膠樹皮層，1 個月后取處理部位樹皮進行組織化學鑒定。目前尚未能像橡膠樹增產刺激劑乙烯利那樣涂抹于成齡橡膠樹割口處來開展JA 能否促進橡膠樹增產的大田實驗。本研究發(fā)現(xiàn)，MeJA 能促進愈傷組織乳管細胞分化，表明其可代替JA 進行乳管細胞分化研究。因此，在橡膠樹的大田生產試驗中，將來可用價格低廉的MeJA來代替價格昂貴的JA 進行，這對開發(fā)新型橡膠樹增產刺激劑，促進橡膠樹生產具有一定意義。