高云飛 林文秋 吳青松 張秀梅 孫偉生 劉勝輝 姚艷麗
關鍵詞:菠蘿;SNP;PARMS;反應體系
中圖分類號:S668.3 文獻標識碼:A
DNA 分子標記是根據基因組中DNA 片段差異來判斷個體間遺傳信息的差異。與傳統(tǒng)表型性狀選擇相比,DNA 分子標記技術在基因或DNA水平上進行選擇,可減少傳統(tǒng)育種中的盲目性、選擇效率低且易受環(huán)境條件影響等問題[1]。早期的分子標記技術主要包括AFLP (amplifiedfragment length polymorphism)、RFLP(restrictionfragment length polymorphism)、RAPD(randomamplified polymorphic)、SSR(simple SequenceRepeats)、SNP(single nucleotide polymorphisms)等。但由于AFLP、RAPD、SSR 等標記存在步驟繁瑣、分型不穩(wěn)定甚至是分型過多無法分辨以及非共顯性等問題,使這些標記技術難以應用于育種工作中[2]。
隨著高通量測序技術的快速發(fā)展,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)標記被廣泛應用于植物中。SNP 廣泛分布于植物基因組中,是最豐富的DNA 變異形式[3-6]?;赟NP 開發(fā)的標記是第3 代的分子標記,被認為是極具應用前景的分子標記[7]。其主要技術有基因芯片技術(gene chips)[8]、直接測序法(directsequencing)[9]、CAPS(cleaved amplified polymorphicsequence)[10]、KASP(kompetitive al-lelespecific PCR)[11]和PARMS(penta-primer amplificationre-fractory mutation system)[12]等。其中,基于等位基因特異擴增的KASP 和PARMS 分型技術是目前主流的分型方法,具有成本低、耗時短、準確性高和通量高等優(yōu)點。PARMS 分型的特點是在ARMS-PCR 的基礎上,增加了2 條帶有不同熒光的引物,經過與相同的反向引物的PCR擴增后,通過檢測待測位點的熒光信號進行分型(圖1)[13]。在作物遺傳圖譜構建、基因定位、種質資源分析、分子標記輔助育種等方面廣泛應用[12, 14],但在果樹上應用較少,僅在桃、葡萄等果樹上得到應用[15-16]。
目前,菠蘿上主要利用SSR[17]、RAPD[18]、AFLP[19]、SRAP[20]和CAPS[21]等分子標記進行遺傳圖譜構建及種質資源遺傳多樣性的分析。但PARMS-SNP 分型技術在菠蘿上的研究尚未見報道。本研究以3 份表型差異較大的菠蘿種質為材料,分析反應體積、引物濃度和DNA 模板用量等因素對PARMS PCR 反應的影響,以期建立適用于菠蘿的PARMS-SNP 分型體系, 為利用PARMS-SNP 分型技術開展菠蘿種質資源鑒定、遺傳圖譜的構建、基因的精細定位和分子標記輔助育種奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
本研究所用材料為農業(yè)農村部菠蘿種質資源圃(湛江)保存的種質,選擇表型差異較大的3份種質‘ Baro Rothchild ‘ James Queen 和‘Maroochy進行PARMS 反應體系的優(yōu)化,65份種質用于體系驗證。
1.2 方法
1.2.1 引物設計根據 130 份菠蘿種質資源重測序數據及其SNP 位點信息,利用Primer Premier 5軟件設計引物,命名為SNP31,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其上游引物序列(SNP31X、SNP31Y)分別為5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACGCGTTCAAAATTTAAAGCCT-3' 和5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGACGCGTTCAAAATTTAAAGCCC-3',下游通用引物序列(SNP31C)為5'-TCGTTTAATTTGAATCAGTCAACAACA-3',其中下劃線和雙下劃線分別為FAM 和HEX 熒光標簽序列。
1.2.2 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法[22]和快速提取法[23]提取65 份種質的葉片總DNA,利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質量,NanoDropOne(Thermo Scientific 公司)檢測DNA 的濃度。
1.2.3 PARMS 的基本反應體系反應體系為10 μL:1μL DNA 模板(100 ng/μL),5 μL PARMSmix(2×),0.45 μL 混合引物,3.55 μL ddH2O。引物混合物在配制PCR 反應前預先混勻制備。
PARMS-PCR 擴增體系為94℃ 15 min;94℃20 s,65℃ 1 min(?0.7℃/循環(huán)),10 個循環(huán);94℃20 s,57℃ 1 min,35 個循環(huán);35℃ 1 min。利用Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 6 讀取擴增產物的終點信號,使用其自帶的軟件進行SNP 分型分析。其中,連接FAM 熒光標簽序列的等位基因型聚合在X 軸附近,連接HEX 熒光標簽序列的等位基因型聚合在Y 軸附近,2 種等位基因的雜合型在中間顯示。其分型結果通過基因型熒光信號點來判斷,熒光信號值越高,PARMS-SNP 分型結果越好。
1.2.4 PARMS 反應體系的優(yōu)化 設置4、6、8、10 μL 等4 種反應體積,其中PARMS master mix(2×)分別為2、3、4、5 μL,100 ng/μL DNA 模板為1 μL,100 μmol/L 引物混合物均為0.15 μL,ddH2O 分別為0.55、1.55、2.55、3.55 μL(表1),對反應體積進行優(yōu)化。在此基礎上進行引物濃度的優(yōu)化,具體為:將SNP31 的3 條引物分別稀釋成25、50、100 μmol/L 等3 種濃度后,進行PARMS反應。在PARMS 反應體積和引物濃度優(yōu)化的基礎上, 將‘ Baro Rothchild ‘ James Queen ‘Maroochy的DNA 分別稀釋成100、50、25 ng/μL 的濃度,進行DNA 的濃度優(yōu)化。
1.2.5 PARMS 反應體系的驗證 利用65 份菠蘿種質進行PARMS 反應體系的驗證。
2 結果與分析
2.1 引物SNP31 的PARMS-SNP 分型結果
本研究在前期重測序的基礎上,根據SNP 位點信息設計特異引物SNP31,該引物能夠將8 份菠蘿種質區(qū)分開來(圖2)。其中,2 份種質的基因型為C:C,信號點為紅色;4 份種質的基因型為T:T,信號點為藍色;2 份種質的基因型為T:C 或C:T,信號點為綠色。表明SNP31 引物對8 份種質的分型效果較好,且陰性對照(NTC)位于原點附近,可用于后續(xù)的實驗。
2.2 不同反應體積對PARMS-SNP 分型的影響
PARMS 反應體系中Master mix 是決定反應成本的主要組成部分,反應體積減少則Mastermix 用量減少(表1),可顯著降低成本。因此,通過分析不同的反應體積對PARMS-SNP 分型的影響,結果表明,反應體積影響基因型信號點的熒光信號值。4、6、8、10 μL 等4 種反應體積,均實現了很好的基因分型。4 μL 的反應體積下,熒光信號值最低;6 μL 的反應體積下,熒光信號強度最強;8 μL 和10 μL 的反應體系處于二者之間(圖3)。綜合PARMS-SNP 分型結果及成本,選擇6 μL 為最佳的反應體系。
2.3 引物濃度對PARMS-SNP 分型的影響
在已優(yōu)化的PARMS 反應體系基礎上,分析引物濃度對PARMS-SNP 分型的影響。結果表明,在引物濃度為25、50、100 μmol/L 時均能較好地進行分型,但其濃度顯著影響熒光值,熒光值隨著引物濃度的增加而增強,濃度為100 μmol/L 分型效果最佳(圖4)。因此,選擇100 μmol/L 作為6 μL反應體積下的最優(yōu)引物濃度。
2.4 DNA 提取方法及濃度對PARMS-SNP 分型的影響
在已優(yōu)化的反應體積和引物濃度的基礎上,為了節(jié)省時間、節(jié)約成本,本研究比較CTAB 法和快速提取法提取菠蘿葉片基因組DNA 對PARMS-SNP 分型的影響。結果表明,2 種提取方法均能對3 份種質進行較好的PARMS-SNP 分型(圖5)。
分析DNA 濃度對PARMS-SNP 分型的影響,結果表明,DNA 濃度對PARMS-SNP 的分型影響較小。其中,以CTAB 法提取的DNA,100 ng 的熒光信號最強,25 ng 和50 ng 的熒光信號差異不顯著(圖5A);而以快速提取法提取的DNA,稀釋100 倍的熒光信號最弱,25 倍的熒光信號最強(圖5B)。因此,CTAB 法提取的總DNA,選擇100 ng 作為最優(yōu)模板量,而快速提取法提取的總DNA,以稀釋25 倍作為最優(yōu)模板量。
2.5 PARMS-SNP 優(yōu)化體系穩(wěn)定性的驗證
根據以上優(yōu)化結果,確定了適用于菠蘿的最佳PARMS 反應體系??偡磻w積為6 μL,其中DNA(25 ng)1 μL,PARMS mix 3 μL,Primer mix(100 μmol/L)0.45 μL,ddH2O 1.55 μL。為驗證該體系的穩(wěn)定性,利用SNP31 對65 份菠蘿種質進行分型。結果表明,利用該體系分型效果較好(圖6),19 份種質資源的基因型為T:T,32 份種質資源的基因型為C:C,14 份種質資源的基因型為T:C 或C:T,說明本研究建立的PARMS-SNP優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。
3 討論
隨著生物技術的發(fā)展,作物育種由傳統(tǒng)的田間選擇育種轉向分子標記輔助育種[24]。然而早期的分子標記技術如依賴于電泳分析,耗時費力且效率低下,影響了其在育種中的應用[25]?;赟NP位點開發(fā)的分子標記技術,具有數量多、通量高、可視化好等優(yōu)點,逐漸成為基因分型的主流技術,廣泛應用于種質資源鑒定、分子標記輔助育種中[26-27]。本研究首次建立了菠蘿PARMS 體系并對其進行優(yōu)化和驗證, 獲得穩(wěn)定、可靠的PARMS-SNP 分型體系,為菠蘿種質資源鑒定、QTL 定位和分子標記輔助育種提供技術支撐。
PARMS 技術受反應體積、引物濃度、DNA模板用量等的影響。反應體積顯著影響基因型信號點的熒光值,大白菜的最適反應體積為4 μL[26],番茄的最小反應體積為5 μL[27],茄子的最小反應體積為6 μL[28]。本研究中,6 μL 的反應體積最佳,4 μL 和10 μL 的反應體系熒光強度減弱,表明反應體積影響PCR 擴增的效果,過高或過低的反應體積均對菠蘿的PARMS-SNP 分型有影響。那么,反應體積如何影響PCR 擴增結果?楊雙娟等[26]分析引物濃度、模板DNA 的用量等發(fā)現,反應體積是通過引物濃度的變化影響分型結果。而引物濃度是通過對引物與DNA 模板的匹配效率來影響KASP 分型結果[29]。引物濃度過低可能會提前消耗殆盡,導致PCR 反應提前終止;引物濃度過高容易發(fā)生非特異性擴增或形成引物二聚體,從而抑制目標序列的擴增[30]。本研究中100 μmol/L 的熒光信號值顯著高于25 μmol/L 和50 μmol/L,表明引物濃度能夠影響分型結果。DNA 模板是影響PARMS-SNP 分型的重要因素,適宜的DNA 模板量是獲得足量特異性擴增產物的前提,DNA 模板濃度過低時,擴增產物較少甚至無擴增條帶;濃度過高時,非特異性產物增加,特異性擴增受到抑制[26-27]。本研究中25~100 ng DNA模板量均能產生較好的PARMS-SNP 分型,表明菠蘿PARMS- PCR反應對模板DNA 的濃度敏感度較小,這一結論與楊雙娟等[26]和肖熙鷗等[28]的結果一致。
傳統(tǒng)CTAB、DNA 提取試劑盒等方法提取DNA 耗時長、成本高,限制PARMS 標記的應用。因此,尋找一種適用于PARMS 標記的快速提取菠蘿基因組DNA 的方法將有助于提高PARMSSNP的分型效率。LU 等[12]發(fā)現原始的DNA 裂解液不能對水稻、小麥、玉米和棉花等作物進行基因分型,但稀釋5~30 倍的DNA 裂解液能將水稻、小麥、玉米成功基因分型,表明快速提取法獲得的DNA 提取液可用于PARMS-SNP 分型,但基因分型的熒光強度受稀釋倍數的影響,稀釋20 倍以上導致熒光強度下降。本研究結果表明,以CTAB提取的DNA 和快速提取DNA 的稀釋液為模板,均能夠完成菠蘿的基因分型,但快速提取法為模板的PCR反應,熒光強度值隨著稀釋倍數的增加,逐漸下降??赡茉蚴请S著稀釋倍數的增加,稀釋液里的模板DNA 濃度下降,導致擴增效率降低,從而導致熒光值減弱。
4 結論
本研究通過對反應體積、引物濃度以及DNA模板用量等影響PARMS PCR 的因素進行優(yōu)化,建立了菠蘿PARMS-SNP 分型體系,其穩(wěn)定性和可靠性得到了驗證。該體系可用于菠蘿種質資源的鑒定、QTL 定位和分子標記輔助選擇等。