高云飛　林文秋　吳青松　張秀梅　孫偉生　劉勝輝　姚艷麗

關(guān)鍵詞：菠蘿；SNP；PARMS；反應(yīng)體系

中圖分類號：S668.3 文獻標識碼：A

DNA 分子標記是根據(jù)基因組中DNA 片段差異來判斷個體間遺傳信息的差異。與傳統(tǒng)表型性狀選擇相比，DNA 分子標記技術(shù)在基因或DNA水平上進行選擇，可減少傳統(tǒng)育種中的盲目性、選擇效率低且易受環(huán)境條件影響等問題[1]。早期的分子標記技術(shù)主要包括AFLP （amplifiedfragment length polymorphism）、RFLP（restrictionfragment length polymorphism）、RAPD（randomamplified polymorphic）、SSR（simple SequenceRepeats）、SNP（single nucleotide polymorphisms）等。但由于AFLP、RAPD、SSR 等標記存在步驟繁瑣、分型不穩(wěn)定甚至是分型過多無法分辨以及非共顯性等問題，使這些標記技術(shù)難以應(yīng)用于育種工作中[2]。

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms， SNP）標記被廣泛應(yīng)用于植物中。SNP 廣泛分布于植物基因組中，是最豐富的DNA 變異形式[3-6]?；赟NP 開發(fā)的標記是第3 代的分子標記，被認為是極具應(yīng)用前景的分子標記[7]。其主要技術(shù)有基因芯片技術(shù)（gene chips）[8]、直接測序法（directsequencing）[9]、CAPS（cleaved amplified polymorphicsequence）[10]、KASP（kompetitive al-lelespecific PCR）[11]和PARMS（penta-primer amplificationre-fractory mutation system）[12]等。其中，基于等位基因特異擴增的KASP 和PARMS 分型技術(shù)是目前主流的分型方法，具有成本低、耗時短、準確性高和通量高等優(yōu)點。PARMS 分型的特點是在ARMS-PCR 的基礎(chǔ)上，增加了2 條帶有不同熒光的引物，經(jīng)過與相同的反向引物的PCR擴增后，通過檢測待測位點的熒光信號進行分型（圖1）[13]。在作物遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、種質(zhì)資源分析、分子標記輔助育種等方面廣泛應(yīng)用[12， 14]，但在果樹上應(yīng)用較少，僅在桃、葡萄等果樹上得到應(yīng)用[15-16]。

目前，菠蘿上主要利用SSR[17]、RAPD[18]、AFLP[19]、SRAP[20]和CAPS[21]等分子標記進行遺傳圖譜構(gòu)建及種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。但PARMS-SNP 分型技術(shù)在菠蘿上的研究尚未見報道。本研究以3 份表型差異較大的菠蘿種質(zhì)為材料，分析反應(yīng)體積、引物濃度和DNA 模板用量等因素對PARMS PCR 反應(yīng)的影響，以期建立適用于菠蘿的PARMS-SNP 分型體系， 為利用PARMS-SNP 分型技術(shù)開展菠蘿種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的精細定位和分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部菠蘿種質(zhì)資源圃（湛江）保存的種質(zhì)，選擇表型差異較大的3份種質(zhì)‘ Baro Rothchild ‘ James Queen 和‘Maroochy進行PARMS 反應(yīng)體系的優(yōu)化，65份種質(zhì)用于體系驗證。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計根據(jù) 130 份菠蘿種質(zhì)資源重測序數(shù)據(jù)及其SNP 位點信息，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，命名為SNP31，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其上游引物序列（SNP31X、SNP31Y）分別為5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACGCGTTCAAAATTTAAAGCCT-3' 和5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGACGCGTTCAAAATTTAAAGCCC-3'，下游通用引物序列（SNP31C）為5'-TCGTTTAATTTGAATCAGTCAACAACA-3'，其中下劃線和雙下劃線分別為FAM 和HEX 熒光標簽序列。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法[22]和快速提取法[23]提取65 份種質(zhì)的葉片總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量，NanoDropOne（Thermo Scientific 公司）檢測DNA 的濃度。

1.2.3 PARMS 的基本反應(yīng)體系反應(yīng)體系為10 μL：1μL DNA 模板（100 ng/μL），5 μL PARMSmix（2×），0.45 μL 混合引物，3.55 μL ddH₂O。引物混合物在配制PCR 反應(yīng)前預(yù)先混勻制備。

PARMS-PCR 擴增體系為94℃ 15 min；94℃20 s，65℃ 1 min（?0.7℃/循環(huán)），10 個循環(huán)；94℃20 s，57℃ 1 min，35 個循環(huán)；35℃ 1 min。利用Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 6 讀取擴增產(chǎn)物的終點信號，使用其自帶的軟件進行SNP 分型分析。其中，連接FAM 熒光標簽序列的等位基因型聚合在X 軸附近，連接HEX 熒光標簽序列的等位基因型聚合在Y 軸附近，2 種等位基因的雜合型在中間顯示。其分型結(jié)果通過基因型熒光信號點來判斷，熒光信號值越高，PARMS-SNP 分型結(jié)果越好。

1.2.4 PARMS 反應(yīng)體系的優(yōu)化 設(shè)置4、6、8、10 μL 等4 種反應(yīng)體積，其中PARMS master mix（2×）分別為2、3、4、5 μL，100 ng/μL DNA 模板為1 μL，100 μmol/L 引物混合物均為0.15 μL，ddH2O 分別為0.55、1.55、2.55、3.55 μL（表1），對反應(yīng)體積進行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上進行引物濃度的優(yōu)化，具體為：將SNP31 的3 條引物分別稀釋成25、50、100 μmol/L 等3 種濃度后，進行PARMS反應(yīng)。在PARMS 反應(yīng)體積和引物濃度優(yōu)化的基礎(chǔ)上， 將‘ Baro Rothchild ‘ James Queen ‘Maroochy的DNA 分別稀釋成100、50、25 ng/μL 的濃度，進行DNA 的濃度優(yōu)化。

1.2.5 PARMS 反應(yīng)體系的驗證 利用65 份菠蘿種質(zhì)進行PARMS 反應(yīng)體系的驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物SNP31 的PARMS-SNP 分型結(jié)果

本研究在前期重測序的基礎(chǔ)上，根據(jù)SNP 位點信息設(shè)計特異引物SNP31，該引物能夠?qū)? 份菠蘿種質(zhì)區(qū)分開來（圖2）。其中，2 份種質(zhì)的基因型為C：C，信號點為紅色；4 份種質(zhì)的基因型為T：T，信號點為藍色；2 份種質(zhì)的基因型為T：C 或C：T，信號點為綠色。表明SNP31 引物對8 份種質(zhì)的分型效果較好，且陰性對照（NTC）位于原點附近，可用于后續(xù)的實驗。

2.2 不同反應(yīng)體積對PARMS-SNP 分型的影響

PARMS 反應(yīng)體系中Master mix 是決定反應(yīng)成本的主要組成部分，反應(yīng)體積減少則Mastermix 用量減少（表1），可顯著降低成本。因此，通過分析不同的反應(yīng)體積對PARMS-SNP 分型的影響，結(jié)果表明，反應(yīng)體積影響基因型信號點的熒光信號值。4、6、8、10 μL 等4 種反應(yīng)體積，均實現(xiàn)了很好的基因分型。4 μL 的反應(yīng)體積下，熒光信號值最低；6 μL 的反應(yīng)體積下，熒光信號強度最強；8 μL 和10 μL 的反應(yīng)體系處于二者之間（圖3）。綜合PARMS-SNP 分型結(jié)果及成本，選擇6 μL 為最佳的反應(yīng)體系。

2.3 引物濃度對PARMS-SNP 分型的影響

在已優(yōu)化的PARMS 反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，分析引物濃度對PARMS-SNP 分型的影響。結(jié)果表明，在引物濃度為25、50、100 μmol/L 時均能較好地進行分型，但其濃度顯著影響熒光值，熒光值隨著引物濃度的增加而增強，濃度為100 μmol/L 分型效果最佳（圖4）。因此，選擇100 μmol/L 作為6 μL反應(yīng)體積下的最優(yōu)引物濃度。

2.4 DNA 提取方法及濃度對PARMS-SNP 分型的影響

在已優(yōu)化的反應(yīng)體積和引物濃度的基礎(chǔ)上，為了節(jié)省時間、節(jié)約成本，本研究比較CTAB 法和快速提取法提取菠蘿葉片基因組DNA 對PARMS-SNP 分型的影響。結(jié)果表明，2 種提取方法均能對3 份種質(zhì)進行較好的PARMS-SNP 分型（圖5）。

分析DNA 濃度對PARMS-SNP 分型的影響，結(jié)果表明，DNA 濃度對PARMS-SNP 的分型影響較小。其中，以CTAB 法提取的DNA，100 ng 的熒光信號最強，25 ng 和50 ng 的熒光信號差異不顯著（圖5A）；而以快速提取法提取的DNA，稀釋100 倍的熒光信號最弱，25 倍的熒光信號最強（圖5B）。因此，CTAB 法提取的總DNA，選擇100 ng 作為最優(yōu)模板量，而快速提取法提取的總DNA，以稀釋25 倍作為最優(yōu)模板量。

2.5 PARMS-SNP 優(yōu)化體系穩(wěn)定性的驗證

根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果，確定了適用于菠蘿的最佳PARMS 反應(yīng)體系?？偡磻?yīng)體積為6 μL，其中DNA（25 ng）1 μL，PARMS mix 3 μL，Primer mix（100 μmol/L）0.45 μL，ddH2O 1.55 μL。為驗證該體系的穩(wěn)定性，利用SNP31 對65 份菠蘿種質(zhì)進行分型。結(jié)果表明，利用該體系分型效果較好（圖6），19 份種質(zhì)資源的基因型為T：T，32 份種質(zhì)資源的基因型為C：C，14 份種質(zhì)資源的基因型為T：C 或C：T，說明本研究建立的PARMS-SNP優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。

3 討論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，作物育種由傳統(tǒng)的田間選擇育種轉(zhuǎn)向分子標記輔助育種[24]。然而早期的分子標記技術(shù)如依賴于電泳分析，耗時費力且效率低下，影響了其在育種中的應(yīng)用[25]?；赟NP位點開發(fā)的分子標記技術(shù)，具有數(shù)量多、通量高、可視化好等優(yōu)點，逐漸成為基因分型的主流技術(shù)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、分子標記輔助育種中[26-27]。本研究首次建立了菠蘿PARMS 體系并對其進行優(yōu)化和驗證， 獲得穩(wěn)定、可靠的PARMS-SNP 分型體系，為菠蘿種質(zhì)資源鑒定、QTL 定位和分子標記輔助育種提供技術(shù)支撐。

PARMS 技術(shù)受反應(yīng)體積、引物濃度、DNA模板用量等的影響。反應(yīng)體積顯著影響基因型信號點的熒光值，大白菜的最適反應(yīng)體積為4 μL[26]，番茄的最小反應(yīng)體積為5 μL[27]，茄子的最小反應(yīng)體積為6 μL[28]。本研究中，6 μL 的反應(yīng)體積最佳，4 μL 和10 μL 的反應(yīng)體系熒光強度減弱，表明反應(yīng)體積影響PCR 擴增的效果，過高或過低的反應(yīng)體積均對菠蘿的PARMS-SNP 分型有影響。那么，反應(yīng)體積如何影響PCR 擴增結(jié)果？楊雙娟等[26]分析引物濃度、模板DNA 的用量等發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體積是通過引物濃度的變化影響分型結(jié)果。而引物濃度是通過對引物與DNA 模板的匹配效率來影響KASP 分型結(jié)果[29]。引物濃度過低可能會提前消耗殆盡，導(dǎo)致PCR 反應(yīng)提前終止；引物濃度過高容易發(fā)生非特異性擴增或形成引物二聚體，從而抑制目標序列的擴增[30]。本研究中100 μmol/L 的熒光信號值顯著高于25 μmol/L 和50 μmol/L，表明引物濃度能夠影響分型結(jié)果。DNA 模板是影響PARMS-SNP 分型的重要因素，適宜的DNA 模板量是獲得足量特異性擴增產(chǎn)物的前提，DNA 模板濃度過低時，擴增產(chǎn)物較少甚至無擴增條帶；濃度過高時，非特異性產(chǎn)物增加，特異性擴增受到抑制[26-27]。本研究中25～100 ng DNA模板量均能產(chǎn)生較好的PARMS-SNP 分型，表明菠蘿PARMS- PCR反應(yīng)對模板DNA 的濃度敏感度較小，這一結(jié)論與楊雙娟等[26]和肖熙鷗等[28]的結(jié)果一致。

傳統(tǒng)CTAB、DNA 提取試劑盒等方法提取DNA 耗時長、成本高，限制PARMS 標記的應(yīng)用。因此，尋找一種適用于PARMS 標記的快速提取菠蘿基因組DNA 的方法將有助于提高PARMSSNP的分型效率。LU 等[12]發(fā)現(xiàn)原始的DNA 裂解液不能對水稻、小麥、玉米和棉花等作物進行基因分型，但稀釋5～30 倍的DNA 裂解液能將水稻、小麥、玉米成功基因分型，表明快速提取法獲得的DNA 提取液可用于PARMS-SNP 分型，但基因分型的熒光強度受稀釋倍數(shù)的影響，稀釋20 倍以上導(dǎo)致熒光強度下降。本研究結(jié)果表明，以CTAB提取的DNA 和快速提取DNA 的稀釋液為模板，均能夠完成菠蘿的基因分型，但快速提取法為模板的PCR反應(yīng)，熒光強度值隨著稀釋倍數(shù)的增加，逐漸下降。可能原因是隨著稀釋倍數(shù)的增加，稀釋液里的模板DNA 濃度下降，導(dǎo)致擴增效率降低，從而導(dǎo)致熒光值減弱。

4 結(jié)論

本研究通過對反應(yīng)體積、引物濃度以及DNA模板用量等影響PARMS PCR 的因素進行優(yōu)化，建立了菠蘿PARMS-SNP 分型體系，其穩(wěn)定性和可靠性得到了驗證。該體系可用于菠蘿種質(zhì)資源的鑒定、QTL 定位和分子標記輔助選擇等。