龔婷婷　李維儀　陶媛　李少凡　王嘉文　楊柏云　羅火林

關鍵詞：蘭科；ABI3 基因；密碼子偏性

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A

編碼同一氨基酸的不同密碼子稱同義密碼子，在不存在外界壓力或者其他干擾因素條件下，同義密碼子的使用頻率是相同的。但是實際情況下，基因在編碼氨基酸時同義密碼子的使用頻率存在一定的傾向，這種現象稱為密碼子偏好性[1]。生物在長時間的進化過程中由于基因突變和外界環(huán)境的影響會形成自身偏好的密碼子系統(tǒng)，當某一密碼子在編碼氨基酸受阻礙時，它的同義密碼子能夠代替其行使功能從而保證蛋白質合成的準確性[2]。早在20 世紀70 年代，在對基因的異源表達進行研究時，人們就意識到密碼子偏性的重要性[3]。密碼子偏好性廣泛存在于生物界中，不僅可以用來描述基因進化規(guī)律、基因表達過程中的調控機制，也可用于預測外源基因的最適宿主，通過密碼子優(yōu)化提高宿主中外源基因的表達量以及評估基因的表達水平等[4-5]。研究表明，原核生物和真核生物中均存在密碼子使用偏好性。目前已有人對辣椒[6]、芒果[7]、陸地棉[8]等高等植物進行了密碼子偏性分析。分析生物對同義密碼子的使用情況特別是偏好性可為該生物的外源基因插入及表達提供一定的理論依據[9]。

蘭科（Orchidaceae）植物作為被子植物的大科之一，是植物保護中的“旗艦”類群[10]。此外，很多蘭科植物具有極高的觀賞價值和藥用作用[11]，受世人的喜愛與追捧。然而其種子細小無胚乳，自然條件下需與適宜的菌根真菌共生才能萌發(fā)，萌發(fā)率低且萌發(fā)時間漫長[12]。為了做好蘭科植物資源的保護與利用工作，針對其種子萌發(fā)的研究也引起越來越多的關注。ABI3 是ABA 信號轉導的中心調控因子，調節(jié)胚胎成熟和幼苗早期發(fā)育之間的過渡，是種子成熟所必需的[13]。目前國內外對蘭科萌發(fā)基因ABI3 基因研究較少。本研究通過CodonW、MEGA 等程序對蘭科ABI3 基因密碼子進行偏性分析，以期優(yōu)化密碼子來提高外源基因的表達量，然后對外源基因進行密碼子改造，提高蘭科種子萌發(fā)率，為蘭科植物種子萌發(fā)的分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以擬南芥ABI3 的基因序列（登錄號為NC_003074.8）為探針，在NCBI 的數據庫中，通過blastn 軟件查找同源的序列，獲得的序列經CDHIT（http：//www.bioinformatics.org/cd-hit/）在線軟件去冗余后，選擇包含300 bp 以上CDS（codingDNA sequence）的序列用于本研究（表1）。

1.2 方法

1.2.1 中性繪圖分析 以GC₃為橫坐標，GC₁₂（GC₁和GC₂的平均值）為縱坐標繪圖，解析密碼子3 個位置堿基組成的相關性。若GC₁₂與GC₃值無顯著性差異，則所有點將沿對角線分布，說明主要來自堿基突變，外界選擇影響弱或者無；反之，則說明選擇效應是基因最主要的進化約束力。

1.2.2 有效密碼子數（effective number of codons，ENC）繪圖分析 ENC 值反映同義密碼子的使用偏好，ENC 值范圍為20～61，當ENC=20 時表示密碼子偏性最強；ENC=61 表示同義密碼子被平均使用，不存在密碼子偏性。ENC 繪圖分析主要反映ENC 與GC₃之間的分布關系，標準曲線ENC=2+GC³+29/（2×GC₃²?2×GC₃+1）[14-15]。當無自然選擇壓力影響時，密碼子偏性僅由堿基突變產生，散點則位于曲線之上，如散點遠離曲線時，則表示自然選擇壓力更多地參與了同義密碼子的使用頻率[16]。

1.2.3 PR2-plot 分析（parity rule 2， PR2） 密碼子奇偶偏好分析主要分析密碼子第三位的奇偶偏性。理論上DNA 的2 條互補鏈，如沒有發(fā)生突變則A=T，G=C。分別以基因A3/（A3+T3），G3/（G3+C3）為橫縱坐標做散點圖，圖中中心A=T且C=G 橫縱坐標均為0.5，從該中心出發(fā)的矢量表示奇偶性的方向與程度[17]。

1.2.4 最優(yōu)密碼子分析 相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage， RSCU）是指對于某一特定的密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間的相對概率，在某一密碼子和與其編碼相同氨基酸的多種同義密碼子之間（同一基因序列上）[18]，是某一個密碼子使用的頻率與平均使用期望值的比值，它去除了氨基酸內部組成對密碼子使用的影響[19]。如果密碼子的使用沒有偏好性，該密碼子的RSCU=1；若RSCU>1，表示密碼子偏性較強，使用頻率相對較高；若RSCU<1，表示基因偏性較弱，基因低表達。由此可以確定基因的最優(yōu)密碼子，并進一步判斷基因密碼子偏好A/T 或C/G 結尾。

將ENC 值由大到小排序，分別將前10%和后10%的基因設為高表達基因庫和低表達基因庫，計算ΔRSCU 值。最優(yōu)密碼子確定：高表達基因庫中RSCU>1；低表達基因庫中RSCU<1；ΔRSCU≥0.2[20-21]。

1.3 數據處理

將獲得的序列整理后，用CodonW 軟件對45條序列進行密碼子組成和偏好性參數分析；在Excel 軟件中對運行獲得密碼子第1、2、3 位上的GC 含量，各堿基ENC、CAI 及RSCU 等值進行整理；運用SPSS13.0、MEGA5.1 軟件進行數據分析和繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 蘭科ABI3 基因的堿基組成及相關性分析

利用CodonW、MEGA 軟件獲得并計算ABI3基因編碼區(qū)序列不同位置的GC 含量、ENC 值和CAI 值（表2）?？侴C（GC_all）含量為42.8%～65.9%，平均值為49.45%，GC1 為43.8%～68.7%，平均值為50.58% ，GC₂ 為41.8%～61.4% ， 平均值為48.48%，GC₃為41.1%～67.6%，平均值為49.33%，接近50%，說明其在編碼氨基酸堿基選擇上對于G/C 和A/T 沒有明顯的偏好性。同樣地，ENC 值范圍在40.84～58.46，平均值為49.81；CAI 平均值為0.203，遠小于1，這些證據都表明這類基因的密碼子偏性較弱。

2.2 中性繪圖分析

ABI3 基因的中性繪圖分析結果顯示（圖1），45 個ABI3 基因坐標點幾乎均沿著圖中對角線分布，有些甚至位于對角線上，表明ABI3 基因主要受堿基突變的影響，來自外界的選擇壓力較小。GC₁₂的范圍為43.50%～65.05%，GC₁₂與GC₃的回歸曲線的斜率為0.6103，R²=0.7928，P<0.05，有極高的相關性，說明堿基組成對密碼子偏性在一定程度上受堿基組成的影響。

2.3 基因密碼子使用參數之間的相關性分析

對基因ENC 值以及密碼子不同位置堿基組成情況進行相關性分析，分析結果如表3 所示，GC₁、GC₂、GC₃任意二者之間均存在極顯著正相關性（P<0.01），說明各基因密碼子三位堿基的組成之間密切相關，受隨機突變或者有一定方向突變壓力的影響較大；這暗示著3 個位點的GC值（GC₁、GC₂、GC₃）都可能對密碼子偏性產生一定程度的影響；而ENC 值與GC₁存在顯著負相關性（P<0.05），與GC₂、GC₃和基因總的GC含量（GCall）都存在極顯著負相關性（P<0.01），與基因編碼氨基酸的長度（Laa）存在極顯著正相關性。說明在基因密碼子中，第3 位堿基組成對密碼子使用模式存在較大的影響。由參數間的相關性可知，同義密碼子堿基所在位置及含量對基因密碼子使用偏好性的影響從大到小排序：GC₃>GC_all>GC₁>GC₂（密碼子使用偏好性越強，ENC值越?。?。

2.4 ENC 與GC₃的關聯分析

以各基因ENC 值為縱坐標，GC₃值為橫坐標做散點圖（圖2）。ABI3 基因GC₃值41.1%～67.6%之間，平均值為49.33%，表明密碼子第3 位堿基GC 變化頻率較大。ENC 值在40.84～58.46 之間，說明不同基因密碼子偏性相差較大。部分分布在標準曲線周圍的ABI3 基因密碼子偏好性主要由突變造成；而在偏離期望曲線位點基因密碼子偏好性受自然選擇影響大；沒有一個點落在曲線上，說明不存在完全由堿基突變的密碼子偏性情況。

2.5 奇偶偏好分析

密碼子奇偶偏好性主要用于分析密碼子第3位發(fā)生奇偶偏性，圖中中心橫縱坐標均是0.5，A=C 且G=C，表示DNA 兩條互補鏈之前不存在突變。由PR2 分析圖（圖3）可知，大多數基因A3/（A3+T3）或G3/（G3+C3）值都偏離了0.5，只有個別基因接近0.5，表明該基因密碼子偏性受基因突變影響大，其他因素的影響依然存在，例如自然選擇等。從橫坐標來看，除個別基因小于0.5，大多數大于0.5，表明第3 位上A 的比例大于T（U），密碼子在A 和T（U）之間具有一定的偏好性；從縱坐標來看，大多數大于0.5，表明第3位上G 的比例大于C。綜上進一步說明了ABI3基因密碼子偏性除了主要受基因突變影響以外還受其他因素的影響。

2.6 ABI3 基因相對同義密碼子使用度分析（RSCU）

通過CodonW 軟件計算45 條ABI3 基因序列的RSCU 值（表4）。結果顯示，RSCU=1 的密碼子有4 個（AAC、UGG、GCC、GCA），表明這幾個同義密碼子無偏性被隨機使用；RSCU>1的密碼子有28 個（占全部密碼子的46.67%），其中以T（U）結尾的有12 個，A 結尾的有7 個，C 結尾的有5 個，G 結尾的有4 個，以A/T（U）結尾的占比67.86%，表明蘭科ABI3 基因偏愛A/T（U）結尾的密碼子，顯著偏愛T（U）結尾的密碼子。

2.7 最優(yōu)密碼子分析

通過ENC 值大小排序，取前后10%值作為高低表達基因庫，計算ΔRSCU 值（表5），確定最優(yōu)密碼子。最終確定了ABI3 基因編碼12 個氨基酸的26 個最優(yōu)密碼子，其中有編碼12 個氨基酸的22 個密碼子ΔRSCU≥0.5，G/C 結尾的有12個，以A/T（U）結尾的有14 個，其中以U 結尾的密碼子有10 個，表明蘭科植物ABI3 基因偏好以A/T（U）結尾的最優(yōu)密碼子，尤其偏愛以T（U）結尾的密碼子。

3 討論

密碼子是基因傳遞信息中的基本結構單位，自然界生物基因組中密碼子偏性使用現象廣泛存在[22]。不同物種在自然選擇中生存下來，密碼子存在一定差異并且有其偏好性，因此對密碼子偏性研究可反映一定的進化特征[23]。作為生物堿基組成重要指標之一，GC 含量可反映密碼子使用偏性突變的整體趨勢[24]，密碼子第3 位GC3 含量通?？勺鳛榉治雒艽a子偏性的主要衡量標準之一。ENC 值可表示偏性的強弱，蘭科植物ABI3 基因的ENC 平均值為49.81，表明在蘭科植物中大部分ABI3 基因密碼子的偏性較弱。通過RSCU 和ΔRSCU 分析，發(fā)現ABI3 基因主要偏愛使用以A/T（U）結尾的密碼子，與KUMAR 等[25]研究馬流感病毒，陳哲等[26]研究菠蘿和WU 等[27]研究的芍藥密碼子偏性使用一致，尤其偏愛以T（U）結尾的密碼子；與其他多數單子葉植物主要偏愛C/G 結尾的密碼子不同，如小麥CBL4 基因密碼子[28]，香蕉Aux/IAA 基因家族密碼子[29]等。在對多種植物基因組密碼子進行偏好性分析中發(fā)現，雙子葉植物的GC 含量最低，而單細胞藻類GC含量最高，說明密碼子使用偏性的程度可能隨物種進化的程度而降低[30]。

影響密碼子偏性的因素主要包括：堿基組成差異、自然選擇、tRNA 豐富度、翻譯效率、蛋白質功能，選擇突變漂變學說等[31]。通過中性繪圖分析、ENC 與GC3 關聯分析和奇偶偏好分析，說明蘭科植物ABI3 基因受堿基突變影響較大，同時也受到其他因素的影響，如選擇壓力。植物基因的密碼子偏性形成過程中，一般受由堿基突變和自然選擇等多重影響，如楊祥燕等[32]研究的菠蘿葉綠體基因密碼子、ZHOU 等[33]研究的一些種子植物葉綠體基因密碼子、梁娥等[34]研究的竹節(jié)參轉錄組密碼子、劉慧等[35]研究的糜子葉綠體基因組密碼子；有時也會其中一個占主導作用，如馬盛超等[18]研究的蓼科大黃屬植物CHS 基因，主要受自然選擇影響。另外，對基因ENC 值以及密碼子不同位置堿基組成情況進行相關性分析發(fā)現，GC1、GC2、GC3 顯著相關，說明同義密碼子3 個位置上堿基含量接近，受隨機突變或者有一定方向突變壓力的影響較大；ABI3 基因同義密碼子堿基所在位置及含量均對基因密碼子使用偏好性產生一定影響。

由于蘭科植物自然生境的破壞和資源的過度開采，野生蘭科植物極度瀕危。瀕危蘭科植物的再生和合理利用有賴于種苗繁殖技術的蓬勃發(fā)展，而該技術的核心問題之一便是種子萌發(fā)。ABI3是種子成熟所必需的，它調節(jié)胚胎成熟和幼苗早期發(fā)育之間的過渡，被視為假定的種子特異性轉錄激活劑[36]?；蚬δ苎芯勘砻髟摶蚩捎行岣叻N子萌發(fā)效率。因此，通過遺傳轉化技術，提高蘭科植物ABI3 基因的表達水平，是解決蘭科植物種子萌發(fā)障礙的重要途徑之一。本研究通過分析ABI3 密碼子偏性并篩選出26 個最優(yōu)密碼子，為優(yōu)化育種提供理論依據，在今后ABI3 基因轉化蘭科植物時，可以對外源基因序列進行適當改造，然后轉化至蘭科植物中，有望提高其表達效率，更有利于培育出種子易萌發(fā)的蘭科花卉。