付鑫琳 朱杰 郭江 文利新 譚國華 劉楊 馬海明

摘? 要：為探討抗病力相關(guān)基因天然抗性相關(guān)巨噬蛋白1（natural resistance associated macrophage protein 1，Nramp1）在安慶六白豬上的遺傳多態(tài)性，本研究利用PCR-RFLP檢測該基因HinfⅠ位點(diǎn)的多態(tài)性；結(jié)果表明：安慶六白豬Nramp1基因A/B位點(diǎn)的A基因和B基因頻率分別為0.40和0.60，這表明安慶六白豬Nramp1基因的B等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。本研究為安慶六白豬抗病力性狀的深入研究打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；Nramp1基因；抗病力性狀；安慶六白豬

天然抗性相關(guān)巨噬蛋白1（natural resistance associated macrophage protein 1，Nramp1）對巨噬細(xì)胞的抗菌活性有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)能抑制多種胞內(nèi)病原體，如牛結(jié)核分枝桿菌、沙門菌和利什曼原蟲等的侵染和易感[1]。動物的Nramp1基因主要在吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞及外周血細(xì)胞中特異性表達(dá)[2]，可提高動物機(jī)體的固有免疫力，影響宿主對多種胞內(nèi)寄生病原微生物的早期免疫反應(yīng)，而且對多種傳染性疾病和自身免疫性疾病的抗性具有非特異性[3]，在豬選種育種過程中是提高綜合抗病力性狀的分子遺傳標(biāo)記位點(diǎn)之一[4]。安慶六白豬具有抗病力強(qiáng)的特性，屬于肉脂兼用型地方豬種。本研究利用PCR-RFLP對安慶六白豬Nramp1基因的HinfⅠ位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，以期為安慶六白豬抗病力性狀的深入研究打下基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

應(yīng)用隨機(jī)抽樣法，采集108個(gè)安慶六白豬耳組織樣本。

1.2 PCR-RFLP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)發(fā)表在GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬Nramp1基因全長序列，通過Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)安慶六白豬通用引物，上游引物為5-TCT CCA CAT CCT CTG TGG CAA-3，下游引物為5-ATG GAG AGT GGT AAC TGC CGT-3，擴(kuò)增目的片段的長度為504 bp，引物由北京三博生物工程有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增

使用特異性引物對樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 17 μL，基因組DNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，dNTP（10 mmol/L） 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Tap DNA聚合酶 1 μL，MgCl2 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)

20 μL酶切反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)產(chǎn)物? ? ?5 μL，內(nèi)切酶HinfⅠ 0.7 μL，10×酶切緩沖液2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足。37 ℃水浴反應(yīng)16 h，用核酸染料染色的2.0％瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，凝膠成像系統(tǒng)觀察成像，根據(jù)限制性酶切圖譜中的特征條帶確定并記錄每份樣本的基因型。

2? 結(jié)果與分析

用2％瓊脂糖凝膠電泳對所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，獲得的產(chǎn)物與目標(biāo)片段大小一致，并且產(chǎn)物條帶穩(wěn)定性和特異性較高，清晰，無雜帶，可直接用于酶切分析。

當(dāng)存在酶切位點(diǎn)時(shí)，內(nèi)切酶HinfⅠ可特異性地將504 bp片段切為332 bp和172 bp兩個(gè)片段。將酶切產(chǎn)物通過2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測分型，共檢測出AA基因型（504 bp），BB基因型（332 bp、172 bp）和AB基因型（504 bp、332 bp、172 bp）（圖1）。

安慶六白豬Nramp1基因的基因型頻率及等位基因頻率見表1。從表1可知，B等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因，有望作為遺傳標(biāo)記。

3? 討論

畜禽抗病力性狀是一個(gè)既受數(shù)量基因調(diào)控，又受環(huán)境因素影響的復(fù)雜的閾性狀，由于其表型的遺傳規(guī)律不服從孟德爾遺傳定律，且呈非連續(xù)性變異，利用常規(guī)的表型選擇來獲得理想的改良進(jìn)展比較困難。因此，利用分子遺傳標(biāo)記輔助育種，可以有效促進(jìn)畜禽抗病力性狀的固定[5]。本研究通過對安慶六白豬Nramp1基因多態(tài)性的分析，發(fā)現(xiàn)B基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因，有可能作為影響畜禽抗病力性狀的候選基因標(biāo)記位點(diǎn)，為豬的抗病力性狀選育積累了有益的資料。

參考文獻(xiàn)

[1] CELLIER M， GOVONI G，VIDAL S，et al．Human natural resistance-associated macrophage protein： cDNA cloning， chromosomal mapping， genomic organization， and tissue-specific expression[J]．Journal of Experimental Medicine，1994，180（5）：1741-1752.

[2] 張斌，韓敏，相德才，等．滇陸豬Nramp1基因多態(tài)性對其在組織中表達(dá)的影響[J]．南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，51（1）：202-208.

[3] 相德才，張斌，劉邵娜，等．迪慶藏豬Nramp1基因第二內(nèi)含子和第二外顯子多態(tài)性位點(diǎn)遺傳分析[J]．養(yǎng)豬，2020（2）：60-62.

[4] SUN H S，WANG L，ROTHSCHILD M F，et al．Mapping of the natural resistance-associated macrophage protein 1 （NRAMP1） gene to pig chromosome 15[J]．Animal Genetics，1998，29（2）：138-140.

[5] 付保強(qiáng)，彭帥，顧亞榮，等．豬Nramp1基因內(nèi)含子6的SNP多態(tài)性分析[J]．現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2018（10）：21-24.