王玉玲 羅丹 陳家鈴 任姝靜 張明浩 劉衛(wèi)

通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1經(jīng)皮共輸送納米載體對(duì)皮膚屏障的修復(fù)作用。采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考察透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1納米載體對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）的增殖能力，細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞分泌絲聚蛋白、水通道蛋白3及緊密連接蛋白-1水平的影響。結(jié)果表明，與游離活性物比較，透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1納米載體能顯著提高HaCaT細(xì)胞增殖能力（P<0.05），增加HaCaT細(xì)胞遷移能力（P<0.01），且能顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌絲聚蛋白、水通道蛋白3及緊密連接蛋白-1水平（P<0.05）。說明透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1納米載體具有修復(fù)皮膚屏障的作用，在新型高性能皮膚屏障修復(fù)護(hù)膚品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸鈉，植物鞘氨醇，三肽-1，經(jīng)皮輸送納米載體，屏障修復(fù)

皮膚作為人體重要的屏障，能夠保護(hù)人體免受外界環(huán)境傷害和維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。皮膚屏障一旦受損，會(huì)導(dǎo)致鎖水力下降、耐受力降低、外界有害物質(zhì)刺激增加，從而使得濕疹、皮炎等皮膚疾病的發(fā)病率上升[1]。角質(zhì)層作為一個(gè)連續(xù)性屏障，主要由角質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間脂質(zhì)構(gòu)成，角質(zhì)形成細(xì)胞在角化過程中產(chǎn)生脂質(zhì)并分泌至表層形成脂膜，角質(zhì)形成細(xì)胞與胞外活性物緊密結(jié)合，形成初步的物理保護(hù)屏障[2]。

透明質(zhì)酸鈉（HA）對(duì)皮膚的作用主要取決于分子量大小。大分子HA主要用于皮膚的保濕，涂于皮膚表面的HA能軟化皮膚的角質(zhì)層，進(jìn)一步增強(qiáng)皮膚角質(zhì)層對(duì)活性物的吸收利用，使皮膚變得細(xì)膩光滑。小分子HA能透過正常皮膚屏障滲入真皮，直接促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、重建與修復(fù)，還可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移[3，4]。

植物鞘氨醇為神經(jīng)酰胺的前體，植物鞘氨醇不僅參與神經(jīng)酰胺生成，同樣具有促進(jìn)人體表皮角化細(xì)胞分化作用[5]。三肽-1作為一種信號(hào)肽，具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)如I和III型膠原蛋白，彈性蛋白，結(jié)構(gòu)糖蛋白如層粘連蛋白和纖維連接蛋白的合成，能夠促進(jìn)皮膚組織更新重建[6]。

鑒于皮膚自有屏障功能的影響，上述活性成分難以透過角質(zhì)層，在皮膚屏障內(nèi)側(cè)難以蓄積至有效濃度范圍，導(dǎo)致皮膚屏障修復(fù)效果減弱甚至消失。采用經(jīng)皮給藥納米載體技術(shù)，從保護(hù)皮膚屏障功能、補(bǔ)充細(xì)胞間脂質(zhì)成分、促進(jìn)角質(zhì)層修復(fù)三大途徑出發(fā)，將這三種途徑的屏障修復(fù)活性成分同時(shí)包載于同一納米載體中，可有效促進(jìn)活性成分透皮吸收、提高其在皮膚中的儲(chǔ)留量，實(shí)現(xiàn)不同作用機(jī)制活性成分的協(xié)同增效[7，8]。本研究構(gòu)建透明質(zhì)酸鈉、植物鞘氨醇和三肽-1的經(jīng)皮共輸送納米載體—屏障修復(fù)納米載體，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)皮膚屏障修復(fù)功效進(jìn)行系統(tǒng)研究和評(píng)價(jià)，以期為高性能的屏障修復(fù)功效護(hù)膚品開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

01實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料

透明質(zhì)酸鈉，華熙生物科技股份有限公司；植物鞘氨醇，韓國斗山；三肽-1，潤(rùn)輝生物技術(shù)（威海）有限公司；1，3-丙二醇，韓國B&B；卵磷脂，上海太偉藥業(yè)股份有限公司；聚甘油-10油酸酯，日本日光化學(xué)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素、胰酶，購自美國Gbico公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)；絲聚蛋白（FLG）、水通道蛋白3（AQP3）和緊密連接蛋白-1（Claudin-1）Elisa試劑盒，購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

高速剪切機(jī)，德國IKA公司；Zetasizer/Nano-ZS90納米電位粒徑分析儀，英國Malvern公司；AMH-3微射流高壓均質(zhì)機(jī)，安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；多標(biāo)記酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer公司；AxioLabA1顯微鏡，蔡司中國公司；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；BB150CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1屏障修復(fù)納米載體的制備

稱取適量植物鞘氨醇、聚甘油-10油酸酯和卵磷脂，45℃水浴加熱溶解，得到油相；另稱取透明質(zhì)酸鈉、三肽-1和1，3-丙二醇加到純化水中，45℃水浴加熱溶解，得到水相；將水相緩慢滴加至油相中并在45℃、800rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌30min，采用微射流高壓均質(zhì)機(jī)將混合溶液均質(zhì)后，冷卻至室溫，得到屏障修復(fù)納米載體。

1.3.2粒徑、PDI與Zeta電位

取適量屏障修復(fù)納米載體，超純水稀釋一定倍數(shù)，用納米電位粒徑分析儀測(cè)定粒徑、多分散指數(shù)（Polymerdispersityindex，PDI）和Zeta電位，粒徑測(cè)定角度為90°，測(cè)試溫度為25℃。

1.3.3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT以1.5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100μL，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入100μL含有不同濃度的游離活性物和屏障修復(fù)納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對(duì)應(yīng)HA濃度為0.2、1、5、25和125μg/mL），對(duì)照組僅加100μLDMEM完全培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育2h后于450nm處測(cè)量各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4HaCaT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT以8×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100μL，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入100μL含有不同濃度的游離活性物和屏障修復(fù)納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對(duì)應(yīng)HA濃度為1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL），對(duì)照組僅加100μLDMEM完全培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育2h后于450nm處測(cè)量各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5HaCaT細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整HaCaT細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜。用微量槍頭在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分，用PBS沖洗劃掉的部分，每孔分別加入含有游離活性物、屏障修復(fù)納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對(duì)應(yīng)HA的濃度為5μg/mL），對(duì)照組僅加DMEM完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中孵育24h后，然后于倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的愈合情況并拍照記錄，采用ImageProPlus軟件計(jì)算出劃痕面積的平均值，計(jì)算劃痕區(qū)愈合率。

1.3.6屏障修復(fù)相關(guān)因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將HaCaT細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔500μL，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。每孔分別加入500μL含有不同濃度的游離活性物、屏障修復(fù)納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對(duì)應(yīng)HA的濃度為1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL），對(duì)照組僅加500μLDMEM完全培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)48h后取上清液，用Elisa試劑盒測(cè)試FLG、AQP3及Claudin-1含量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，使用ANOVA法評(píng)估兩組結(jié)果差異，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

02結(jié)果與討論

2.1理化性質(zhì)表征

采用納米電位粒徑分析儀測(cè)得屏障修復(fù)納米載體粒徑為134.2±1.3nm，PDI為0.271±0.014，Zeta電位為-18.2±1.5mV，屏障修復(fù)納米載體的粒徑分布見圖1。

2.2對(duì)HaCaT細(xì)胞安全性影響

表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是構(gòu)成皮膚表皮層的主要細(xì)胞類型，并且具有表皮構(gòu)成、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞角化、細(xì)胞因子分泌和免疫監(jiān)視等功能，常被用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為體外皮膚研究的細(xì)胞系，對(duì)皮膚屏障修復(fù)具有顯著影響[9]。采用CCK-8法檢測(cè)評(píng)價(jià)屏障修復(fù)納米載體安全性，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定合適的給藥劑量。

如圖2所示，當(dāng)屏障修復(fù)納米載體中HA濃度在0.2～125μg/mL范圍內(nèi)，游離活性物和屏障修復(fù)納米載體組HaCaT細(xì)胞活性均在80%以上，無明顯細(xì)胞毒性。但HA濃度在125μg/mL時(shí)，屏障修復(fù)納米載體HaCaT細(xì)胞存活率降低，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的HA濃度為1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL。

2.3促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖

將不同濃度的游離活性物與屏障修復(fù)納米載體處理HaCaT細(xì)胞48h后，采用CCK-8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞存活率變化見圖3。

如圖3所示，與空白對(duì)照比較，游離活性物和屏障修復(fù)載體均能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖（P<0.05或P<0.01）；與游離活性物比較，HA濃度為5μg/mL和25μg/mL時(shí)，屏障修復(fù)載體對(duì)HaCaT細(xì)胞具有明顯的促增殖作用（P<0.05或P<0.01），說明屏障修復(fù)載體能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，且效果優(yōu)于同濃度游離活性物。

2.4促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移

在傷口愈合的早期階段，表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞被激活，并遷移到創(chuàng)傷部位誘導(dǎo)傷口收縮，接著進(jìn)行細(xì)胞增殖以皮膚修復(fù)重建，因此，角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)于傷口愈合有重要作用[10]。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，比較0h和24h劃痕面積變化，探討游離活性物和屏障修復(fù)納米載體對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，在HaCaT細(xì)胞中，HA濃度為5μg/mL時(shí)，與空白對(duì)照組比較，游離活性物和屏障修復(fù)納米載體均能極顯著增加HaCaT細(xì)胞遷移率（P<0.01），與游離活性物組比較，屏障修復(fù)納米載體均能極顯著增加HaCaT細(xì)胞遷移率（P<0.01），說明復(fù)合屏障修復(fù)載體能夠顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的遷移融合，具有良好的皮膚屏障修護(hù)效果，且效果優(yōu)于同濃度游離活性物。

2.5提高屏障修復(fù)因子FLG水平

FLG分布于表皮顆粒層和透明層，對(duì)維持角質(zhì)層的物理強(qiáng)度和阻止外來抗原侵入至關(guān)重要。FLG可促進(jìn)表皮分化，在FLG單體協(xié)助連接下，角蛋白成纖維束有規(guī)則地聚集，進(jìn)而引起細(xì)胞緊密的狀態(tài)，形成表皮角質(zhì)層的屏障結(jié)構(gòu)，其降解可形成天然保濕因子[11]。采用ELISA法檢測(cè)屏障修復(fù)納米載體對(duì)HaCaT細(xì)胞外基質(zhì)中FLG的影響，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，與空白對(duì)照比較，游離活性物和屏障修復(fù)納米載體均能極顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌FLG（P<0.01）；HA濃度1μg/mL、5μg/mL時(shí)，與游離活性物比較，屏障修復(fù)納米載體促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌FLG水平顯著提高（P<0.05或P<0.01）。

2.6提高屏障修復(fù)因子AQP3水平

AQPs是角質(zhì)形成細(xì)胞中與水分子通透性有關(guān)的一個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道，AQP3可將水分、甘油、甘油三脂轉(zhuǎn)運(yùn)至表皮，保持表皮水分，對(duì)皮膚屏障修復(fù)、保濕具有積極作用[12]。采用ELISA法檢測(cè)屏障修復(fù)納米載體對(duì)HaCaT細(xì)胞外基質(zhì)中AQP3的影響，結(jié)果見圖6。

如圖6所示，與空白對(duì)照比較，游離活性物HA濃度5μg/mL、25μg/mL時(shí)，屏障修復(fù)納米載體HA濃度1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞分泌AQP3含量顯著提高（P<0.05或P<0.01）。HA濃度1μg/mL時(shí)，與游離活性物比較，屏障修復(fù)納米載體促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌AQP3水平顯著提高（P<0.01）。

2.7提高屏障修復(fù)因子Claudin-1水平

緊密連接蛋白包括Claudin家族蛋白、閉合蛋白Occludin、連接黏附分子家族蛋白以及緊密連接斑塊蛋白，對(duì)于維持表皮細(xì)胞的選擇滲透性屏障功能至關(guān)重要。其中，Claudin-1是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)最重要的組成活性物，與多種皮膚疾病的發(fā)生息息相關(guān)[13]。采用ELISA法檢測(cè)屏障修復(fù)納米載體對(duì)HaCaT細(xì)胞外基質(zhì)中Claudin-1的影響，結(jié)果見圖7。

如圖7所示，與空白對(duì)照比較，游離活性物HA濃度5μg/mL、25μg/mL時(shí)，屏障修復(fù)納米載體HA濃度1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞分泌Claudin-1含量顯著提高（P<0.01）。HA濃度25μg/mL時(shí)，與游離活性物比較，屏障修復(fù)納米載體促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌Claudin-1水平顯著提高（P<0.05）。

03結(jié)論

本研究制備的屏障修復(fù)經(jīng)皮共輸送納米載體包含透明質(zhì)酸鈉、植物鞘氨醇和三肽-1三種主要活性成分，按照屏障修復(fù)作用機(jī)制進(jìn)行配伍，協(xié)同增效。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，屏障修復(fù)納米載體對(duì)HaCaT細(xì)胞安全無毒性，與游離活性物比較，屏障修復(fù)納米載體可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖及細(xì)胞遷移，且能增加HaCaT細(xì)胞分泌屏障相關(guān)因子FLG、AQP3和Claudin-1的水平。本研究提示，透明質(zhì)酸鈉、植物鞘氨醇和三肽-1等活性成分經(jīng)納米載體包裹后得到的屏障修復(fù)經(jīng)皮共輸送納米載體，在高性能屏障修復(fù)化妝品產(chǎn)品中具有良好的應(yīng)用前景。