呂志強 張瀅

摘要：茶因其口感獨特并含有多種有益健康的活性成分而深受消費者青睞，已成為世界上消費最多的飲品之一。然而，茶葉在種植、采摘、加工、儲存和運輸過程中存在被真菌毒素污染的風(fēng)險，對人類健康造成威脅。文章從近5 年文獻報道的各類茶葉中真菌毒素的檢測方法和檢測結(jié)果進行綜述，旨在為茶葉質(zhì)量安全監(jiān)督提供參考。

關(guān)鍵詞：茶葉；真菌毒素；檢測；研究進展

中圖分類號：TS272；TS201.6? ?文獻標識碼：A? ?文章編號：1000－3150 （2023） 05-12-9

因茶及其制品含有多種對健康有益的成分，能預(yù)防如癌癥、糖尿病、肥胖和心腦血管疾病等[1-3]，所以深受國內(nèi)外消費者的青睞，已成為世界上消費最多的飲品之一。然而，有不少研究報道茶存在被真菌毒素污染的風(fēng)險[4-8]，引起了社會的廣泛關(guān)注和消費者的諸多疑慮。真菌毒素是廣泛分布于食品中的產(chǎn)毒真菌的次級代謝產(chǎn)物，其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在食品加工處理過程中很難被破壞，經(jīng)食物鏈進入人體后可造成潛伏、慢性和急性毒性，具有較強的致畸、致癌、免疫抑制、神經(jīng)毒性和肝腎毒性等毒副作用，嚴重威脅著人類的健康[9-10]。世界衛(wèi)生組織已將真菌毒素納入食品安全體系重點監(jiān)測對象，我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017） 已對部分食品中的真菌毒素做了限量規(guī)定，但未涉及茶葉制品[11]。由于茶葉生產(chǎn)鏈長，在種植、采摘、生產(chǎn)加工、運輸及貯藏過程中均可能受到產(chǎn)毒真菌的污染，產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境下繁殖產(chǎn)毒，導(dǎo)致真菌毒素不斷累積[12]，因此，很有必要對茶葉中真菌毒素進行監(jiān)測。

1 茶葉中真菌毒素的檢出現(xiàn)狀

目前已知的真菌毒素有400 余種，茶葉中常見的主要包括黃曲霉毒素（AFs）、赭曲霉毒素（OTA）、伏馬毒素（FBs）、T-2 毒素（T-2）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、柄曲霉素（STC） 和橘青霉素（CIT）等[13-14]。成分復(fù)雜的茶基質(zhì)（含有多酚、咖啡堿、氨基酸、嘌呤生物堿、皂苷、黃酮醇及其苷等成分） 勢必會對檢測造成干擾，這使茶葉中真菌毒素的檢測更具挑戰(zhàn)性[4，15-16]，此外真菌毒素在低濃度水平就能引發(fā)毒性反應(yīng)，所以前處理方法的適用性，檢測方法的靈敏度、準確度及選擇性顯得尤為重要，會顯著影響檢測結(jié)果[17]。

1.1 未發(fā)酵茶、微發(fā)酵茶及半發(fā)酵茶中真菌毒素檢出概況

根據(jù)制作工藝，綠茶屬于未發(fā)酵茶，微發(fā)酵茶一般指白茶和黃茶，而烏龍茶（青茶） 屬于半發(fā)酵茶。

王鷺等[18]采用固-液萃取結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS） 對20 份茶葉（綠茶4份、紅茶6 份、普洱茶7 份、青茶3 份） 進行8 種真菌毒素的檢測，在2 份綠茶和1 份青茶中檢出黃曲霉毒素B2 （AFB2）。Mannania 等[19]對從摩洛哥3個地區(qū)（EI Jadida，Kénitra 和Meknès） 收集的129份綠茶中的黃曲霉毒素B1 （AFB1）、AFB2、黃曲霉毒素G1 （AFG1）、黃曲霉毒素G2 （AFG2） 進行了研究， 以固- 液萃取提取樣品， 三氟乙酸（TFA） 進行AFs 衍生化，高效液相色譜串聯(lián)熒光檢測器法（HPLC-FLD） 進行定量分析，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS） 對可疑樣品進行確認，結(jié)果檢出76 份樣本陽性。Jai 等[20]運用LC-MS/MS對111 份綠茶中的15 種真菌毒素進行篩查，提取方法為改進的液-液微萃取法（DLLME），檢出的真菌毒素包括交鏈孢酚（AOH）、ZEN、AFG1、AFB2、恩鐮孢菌素（ENB） 和騰毒素（TENT）。Pakshir 等[21]采用免疫親和柱（IAC） 結(jié)合HPLCFLD檢測15 份綠茶中AFs 和OTA 的含量，結(jié)果2份檢出AFB1，11 份檢出OTA。Kiseleva 等[22]采用UHPLC-MS/MS 對俄羅斯市售的多種茶葉中的29種真菌毒素進行了篩查，提取方法為固-液萃取，離心后取上清液直接分析，結(jié)果在未包裝的4 份綠茶中有1 份檢出了霉酚酸（MPA） 和博維霉素（BEA），在具有包裝的4 份綠茶中有1 份檢出T-2，3 份檢出MPA，2 份檢出BEA，2 份檢出乙?；撗跹└牭毒┐迹ˋcDON）。Reinholds 等[23]以固-液萃取結(jié)合固相萃取柱（SPE） 為前處理方法，采用二維液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法（2DLC-TOF-MS） 在43 份綠茶中檢出了AFB1、柄曲霉素（STC）、OTA、DON、3-AcDON、T-2、HT-2 和互隔交鏈孢霉素（ALT）。劉文靜等[24] 采用QuEChERS 法（快速、容易、廉價、有效、堅固、安全） 結(jié)合SPE 對茶葉進行前處理，UPLC-MS/MS檢測，結(jié)果顯示在福建各地區(qū)共計121 份陳年老茶（烏龍茶38 份、白茶53 份、紅茶30 份） 中僅有1 份烏龍茶被檢出AFB1。Areo 等[25]從南非市場上收集了100 份茶葉（包括天然茶、香料茶、草藥茶、綠茶、紅茶、烏龍茶和白茶），采用QuECh-ERS 法結(jié)合UPLC- MS/MS 進行AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和ZEA的篩查，結(jié)果26 份被檢出AFG1 （1.72～5.19 μg/kg）。Zhou 等[26]在自制純化柱的基礎(chǔ)上結(jié)合UPLC-MS/MS 開發(fā)了一種簡便的用于茶中16 種真菌毒素檢測的方法，結(jié)果顯示20 份綠茶和20 份烏龍茶中檢出的主要真菌毒素包括AFs、α- 玉米赤霉烯醇（α-ZEL）、β-ZEL、DON和CIT。

1.2 全發(fā)酵茶（紅茶） 中真菌毒素檢出概況

紅茶是以適宜的茶樹鮮葉經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工藝加工而成，茶葉中的化合物在加工過程中經(jīng)歷了復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，如茶多酚在多酚氧化酶作用下氧化聚合形成茶黃素、茶紅素和茶褐素等，從而形成了紅茶的獨特風(fēng)味[27]。雖然在紅茶的發(fā)酵過程中并沒有微生物參與，但仍有不少文獻報道在紅茶中檢出多種真菌毒素。

王鷺等[18]檢測的6 份紅茶中有2 份分別檢出AFG1 （印度產(chǎn)） 和AFB2 （南非產(chǎn)）。Toman 等[28]運用HPLC-FLD 對土耳其紅茶中OTA的含量及茶湯的轉(zhuǎn)移率進行了研究，在50 個樣本中檢出4 個陽性，OTA 從紅茶到茶湯的轉(zhuǎn)移率為（41.5 ±7.0）%。Carraturo 等[29]應(yīng)用IAC結(jié)合HPLC-FLD在32 份茶樣中檢出11 份紅茶和11 份綠茶含有OTA，沖泡過程中OTA 的轉(zhuǎn)移率紅茶為（33.65 ±4.37）%， 綠茶為（54.47 ± 14.48）%。Gazioglu等[30]運用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA） 測定了土耳其多種食品中的OTA，其中紅茶中OTA的最高含量為139.5 μg/kg。Garbowska 等[31]收集了波蘭市場上流行的紅茶、綠茶、黑茶，每種茶各5 種品牌，用1.5 g 茶葉制備成200 mL茶水，經(jīng)IAC 處理后，運用HPLC-FLD 在紅茶中檢出了OTA。Pakshir等[21]評估的45 份紅茶中有18 份被檢出AFs；41份被檢出OTA。Reinholds 等[23]在63 份紅茶中檢測到了DON、3-AcDON、15-AcDON、OTA、ALT以及較低濃度水平的AFs，但其中兩個樣本的AFs含量較高，一個是肯尼亞的散裝紅茶，AFB1 和AFB2 的含量分別為13.90 μg/kg 和12.10 μg/kg；另一個印度香料紅茶中AFB1 為39.00 μg/kg，AFB2為11.10 μg/kg， AFG1 為41.70 μg/kg， AFG2 為9.95 μg/kg， AFB1 和AFG1 是該樣本中AFs（101.75 μg/kg） 的主要毒素。劉文靜等[24]檢測的30份紅茶中有1 份檢出了OTA。Zhou 等[26]在20 份紅茶中檢測到了AFs、α-ZEL、β-ZEL、DON、15-AcDON 和CIT。Abbasi 等[32]運用IAC 結(jié)合HPLCFLD對40 份從印度、斯里蘭卡、肯尼亞和越南進口到Bushehr 港的紅茶進行了AFB1 檢測，結(jié)果顯示肯尼亞和越南的紅茶中的AFB1 的含量分別為（24.33±1.52）ng/g和（42.66±3.05） ng/g。Zhao 等[33]改進了QuEChERS 法，運用LC-MS/MS 建立了一種簡單、快速、靈敏、可靠的分析方法，對從中國不同市場上隨機采集的126 份茶葉的AFB1 和STC進行分析，結(jié)果未檢出AFB1，但在17 份樣本中檢測到了STC，紅茶、綠茶和烏龍茶中STC 的檢出率分別為5%、8.9%和33.3%。

1.3 后發(fā)酵茶中真菌毒素檢出概況

后發(fā)酵茶是由酶、微生物和濕熱三者綜合作用而得，主要包括湖南黑茶、湖北青磚茶、四川邊茶、安徽古黟黑茶、云南普洱茶、廣西六堡茶及陜西黑茶。渥堆發(fā)酵在后發(fā)酵茶獨特風(fēng)味和口感的形成中起著至關(guān)重要的作用，但大量微生物參與發(fā)酵過程導(dǎo)致其被真菌毒素污染的風(fēng)險大大增加[34]。

Zhang 等[35]以固-液萃取結(jié)合LC-MS/MS為檢測方法，結(jié)果顯示15 份生普洱茶中有9 份檢出展曲霉素（PAT），16 份熟普洱茶中有2 份檢出PAT。姚婷等[36]以固-液萃取結(jié)合IAC 為前處理方法，運用UPLC-Q-TOF-MS （超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法） 建立了黑茶中AFB1 的快速分析方法，在市售的33 種黑茶中均檢出了AFB1，并發(fā)現(xiàn)樣品的年份越久，倉儲時間越長，AFB1 含量越高。劉妍等[37]采用固-液萃取和QuEChERS 處理樣品， 結(jié)合UPLC- MS/MS 建立了黑茶中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、3-AcDON、ZEN、T-2、HT-2和OTA的簡單、快速、高靈敏度的檢測方法，對市售的61 份茶樣品（云南普洱茶30 份、湖南黑茶15 份、廣西六堡茶10 份和湖北老青茶6份） 進行了定量與定性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 份普洱茶和2 份黑茶被檢出AFB1，1 份普洱茶和2 份黑茶被檢出DON，2 份普洱茶和3 份黑茶被檢出OTA。胡琳等[38]采用固-液萃取結(jié)合IAC 處理樣品，運用UPLC-MS/MS 研究建立了云南普洱茶中16 種真菌毒素的檢測方法，在174 份普洱茶中檢出了FB1、FB2、FB3 和DON。Bogdanova 等[39]以固-液萃取和SPE為前處理方法，運用在線二維多中心切割液相色譜- 飛行時間質(zhì)譜（Online- heart- cutting- 2DHPLC-TOF-MS） 研究開發(fā)了同時檢測普洱茶中潛在的70 種真菌毒素的分析方法，在從Latvian 市場和茶館收集的20 份普洱茶中檢出的真菌毒素包括：DON、3-AcDON、15-AcDON、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇- 3- 葡萄糖苷（D3G）、赭曲霉毒素B（OTB）、恩鐮孢菌素A （ENNA）、恩鐮孢菌素B（ENNB）、ALT、AFB1、AFG1、STC、T- 2 和ZEN。Cui 等[40]研究開發(fā)了一種基于IAC 和LC-MS用于定量分析黑茶中4 種AFs 的快速分析方法，在158 份黑茶中檢出1 份康莊茶含有AFB1，1 份福莊茶含有AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2。Li 等[41]同時采用HPLC-FLD 和UPLC-MS/MS 對六堡茶中潛在的產(chǎn)毒真菌和CIT 進行了研究，在113 份六堡茶樣品中有32.7%的樣品檢出CIT，并得出六堡茶中CIT 的濃度高低受儲藏氣候條件和水分活度影響較大的結(jié)論，水分活度高時有利于產(chǎn)毒真菌增殖和真菌毒素的產(chǎn)生。Ye 等[42]研究開發(fā)了一種多功能柱-免疫親和柱（MFC-IAC） 作為前處理方法，運用高效液相色譜串聯(lián)熒光和紫外檢測器法（HPLCFLD-UV） 對108 份中國黑茶進行了6 種真菌毒素的篩查，結(jié)果只有ZEN 和OTA被檢出。Li 等[43]運用HPLC-UV 和GC?MS 開發(fā)了檢測多種茶中PAT含量的方法，對7 類共219 份中國茶葉進行篩查，其中17 份普洱茶和38 份黑茶被檢出PAT。Zhou等[26] 在20 份黑茶中檢測到了AFs、α- ZEL、β-ZEL、DON、OTA 和CIT。Gholizadeh 等[44]首次采用超聲輔助混合溶劑提取法結(jié)合磁性離子液體輔助分散液-液微萃取法（UA-MSE-MIL-EA-DLLME）作為從茶樣品中提取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA 的方法，再結(jié)合HPLC-FLD 進行檢測，在研究的15 份黑茶中均檢出了AFB1，2 份樣品檢出了AFG1，5 份樣品檢出了OTA。Chen 等[45]研究建立了六堡茶中CIT的相關(guān)合成基因，采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR） 和HPLC-FLD對六堡茶不同生產(chǎn)階段的真菌產(chǎn)毒能力和CIT 含量進行了分析。結(jié)果顯示17 個樣品在發(fā)酵過程中均被檢出CIT，早期（發(fā)酵5 d） 和中期（發(fā)酵25 d） 的含量最高，分別為86.75 μg/kg 和96.25 μg/kg；PCR結(jié)果顯示發(fā)酵過程中CIT生物合成基因的Ct 值均小于33.5，表明CIT 污染為高風(fēng)險，而老化過程中僅2 個樣品被檢出CIT （24.75、24.00 μg/kg），且Ct 值在老化過程中顯著升高，說明CIT生物合成途徑受到抑制。

2 茶葉中真菌毒素的檢測方法

表1 匯總了以上文獻報道的茶葉中真菌毒素的檢測方法及評價指標。茶葉基質(zhì)的復(fù)雜性使前處理在檢測中顯得至關(guān)重要，以上綜述的研究中應(yīng)用較多的是固-液萃取、液-液萃?。↙LE）、固相萃?。⊿PE）、QuEChERS 以及IAC，有些研究對以上方法進行優(yōu)化和改進，如超聲輔助混合溶劑提取法與磁性離子液體輔助分散液-液微萃取法、懸浮固化分散液液微萃取法（DLLME-SFO） [46]、MFCIAC以及將兩種SPE 柱聯(lián)用以達到更好的凈化效果； 真菌毒素的分析方法主要包括HPLC-FLD（UV 或DAD）、LC （UPLC） - MS/MS、ELISA、電化學(xué)法傳感器法和高光譜成像法等[47]，其中應(yīng)用于茶葉的主要包括HPLC-FLD 和UPLC-MS/MS。一些特異性強、靈敏度高、快速簡便的方法，如ELISA 和PCR 也有應(yīng)用，但其選擇性、精密度和準確性還有待提高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；雖然HPLC-FLD的靈敏度、精密度和準確度較高，但應(yīng)用范圍窄，不是所有的目標化合物在選擇的條件下都能發(fā)生熒光，且易受干擾，易出現(xiàn)假陽性，對前處理要求較高[15]。LC （UPLC） -MS/MS 具有選擇性強、靈敏度高、精密度好、準確性高、高通量和假陽性率低等優(yōu)點，既能定性和定量，又能同時測定多種真菌毒素，在以上綜述的研究中應(yīng)用也最多。

3 茶葉中真菌毒素的檢測結(jié)果及風(fēng)險評估

3.1 檢測結(jié)果

表2匯總了以上文獻報道的茶葉中真菌毒素的具體檢測結(jié)果。綜上而言，綠茶中檢出頻次較多的真菌毒素包括AFB1 （0.46～41.80 μg/kg）、AFB2（1.20～75.40 μg/kg） 和OTA （0.54～20.35 μg/kg），同時AFG1、AFG2、DON、3-AcDON、AcDON、T-2、STC、ZEN、TENT、ALT、α-ZEL、β-ZEL、ENB、AOH、MPA、PAT和CIT在部分綠茶中被檢出。對烏龍茶、白茶和黃茶的研究相對較少。紅茶中檢出頻次較多的包括AFB1 （0.39～42.66 μg/kg）、AFG1（4.60～41.70μg/kg）和OTA（0.35～139.50μg/kg），同時在部分紅茶中檢出了CIT、DON、3- Ac-DON、15- AcDON、α- ZEL、β- ZEL、ALT 和STC。盡管紅茶和綠茶中檢出頻次較多的真菌毒素相似，即AFs 和OTA，但從含量水平看，紅茶中OTA的含量高于綠茶，而綠茶中AFs 的含量比紅茶略高，同時綠茶中檢出的真菌毒素種類比紅茶多。后發(fā)酵茶與微生物的關(guān)系最為密切，因此被檢出陽性的可能性較大，如在普洱生茶中檢測到的PAT平均含量為1 169 μg/kg，在來源于拉脫維亞的茶樣中DON 含量范圍為145～8 946 μg/kg，3-AcDON 含量范圍為145～4 197 μg/kg，15-AcDON含量范圍為113～3 601 μg/kg。黑茶中檢測到的OTA 含量范圍為0.30～11 354.64 μg/kg，CIT 含量范圍為7.80～206.10 μg/kg，此外OTB、D3G、ENNA、ENNB、ALT、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、FB3、STC、T- 2、ZEN、α-ZEL、β-ZEL 在部分后發(fā)酵茶中均有檢出。另外，同種類茶葉中所檢出的真菌毒素的種類和含量在不同研究中差異較大，這可能與茶葉原料、加工、包裝、運輸及儲存環(huán)境（如溫度、氣候、濕度等） 等因素存在差異有關(guān)。

3.2 風(fēng)險評估

目前針對茶葉中真菌毒素限量標準，僅有印度規(guī)定了紅茶中AFs限量為30.00 μg/kg，阿根廷規(guī)定了涼茶沖泡原料中AFB1和AFs限量為5.00 μg/kg和20.00 μg/kg，以及關(guān)稅同盟國（亞美尼亞、白俄羅斯、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和俄羅斯） 規(guī)定了普洱生茶中AFB1 限量為5.00 μg/kg[12，14]。我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》（GB2761—2017） 已對部分食品中的真菌毒素做了限量規(guī)定，但未涉及茶葉制品。另外，通過飲茶攝入人體的真菌毒素的量能否危害人體健康還缺乏足夠的研究數(shù)據(jù)。Ismail 等[5]評估了通過飲用巴基斯坦木爾坦市的品牌和非品牌紅茶所攝入的AFs的EDI （估計的每日攝入量），結(jié)果并沒有樣本超過TDI （每日最大耐受量），但對經(jīng)常大量攝入茶葉的消費者來說，毒性的可能性仍然存在。Jai 等[20]評估了綠茶中ZEN、AOH、ENB 和TENT 的PDI（可能的每日攝入量），與TDI比較后得出通過飲用來自摩洛哥的綠茶而攝入的真菌毒素對消費者并沒有安全風(fēng)險。Reinholds 等[23]假設(shè)了最壞的情況，即以茶葉中發(fā)現(xiàn)的真菌毒素完全轉(zhuǎn)移到茶湯中為前提進行風(fēng)險評估，結(jié)果顯示OTA和DON的PDI 分別為TDI 的0.88% ～2.05% 和2.50% ～78.9%，表明所檢測的茶葉對消費者是安全的。Ye等[42]對昆明、普洱和烏蘭巴托3 個地區(qū)不同年齡和性別群體進行6 種真菌毒素的膳食風(fēng)險評估，確定性風(fēng)險評估和概率估計顯示3 個地區(qū)飲用黑茶沒有健康風(fēng)險。Li 等[43]通過對多種類型茶中的PAT進行的大量調(diào)查表明，PAT只出現(xiàn)在少量茶樣品中，且總體濃度較低，即使是飲用大量濃茶也不會導(dǎo)致攝入危險劑量的PAT。

4 展望

以上綜述的研究主要是以茶葉為研究對象，而實際生活中人們食用的是用茶葉沖泡或制備的茶飲品，茶飲品中真菌毒素的含量可直接反映飲用者的暴露風(fēng)險，因此，在制備茶飲品時真菌毒素的轉(zhuǎn)移率及茶飲品中真菌毒素的含量是值得重點研究的方向[48-49]。目前，針對茶葉中真菌毒素的膳食風(fēng)險評估的數(shù)據(jù)還相當有限，且主要參考其他食品的評估方法，這并不符合飲茶的特點（開水沖泡、飲用茶湯、棄去茶渣），因此應(yīng)研究完善其風(fēng)險評估方法以得到更科學(xué)準確的結(jié)論。部分文獻的研究結(jié)果顯示在所檢測的茶樣品中并未檢測到真菌毒素[50-51]，這除了與檢測方法有關(guān)外，也說明并不是所有的茶葉都會被污染，通過控制加工條件、選擇適宜的包裝和保障流通環(huán)節(jié)適宜的溫濕度等可有效降低被污染的風(fēng)險。同時，期望我國能盡早制定茶葉中真菌毒素的檢測標準及限量規(guī)定，為提高我國茶葉的質(zhì)量、防止茶葉出口受到貿(mào)易壁壘及保障消費者的飲食安全提供有力的技術(shù)支持。