崔文寧 朱淑新 孟靜靜 王燦 王茜 王芳芳

摘 要： 【目的】褐化是植物組織培養(yǎng)中酚類物質(zhì)被氧化成黑褐色的醌類物質(zhì)的過程，是影響植物組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導率的關(guān)鍵影響因素，該試驗是為了研究不同類型的防褐劑對其的抑制效果，并為后續(xù)‘中矮1號的離體快繁研究解決瓶頸問題?！痉椒ā吭囼灢捎肁gNO 3、活性炭（AC）、Na 2S 2O 3、聚乙烯吡絡(luò)烷酮（PVP）、抗壞血酸（維生素C）5種防褐劑對‘中矮1號葉片進行防褐化研究?！窘Y(jié)果】相比CK組，添加防褐劑可有效緩解組培過程中外植體的褐化情況。其中，維生素C處理組的防褐效果最好，褐化率均在50.00%以內(nèi)，0.05 g/L的維生素C抗褐化效果最佳，褐化率僅為18.75%；8.0 g/L的PVP效果最差，褐化率高達71.25%，且培養(yǎng)基受浸染褐化嚴重?！窘Y(jié)論】褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生有內(nèi)外多重因素，包括外植體的基因型、母體年齡、取材部位、取材時間及大小等，褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累也是導致外植體褐變率增加的一個重要因素，MS和1/2MS等固體培養(yǎng)基不利于醌類等毒害物質(zhì)的擴散，而且會導致其短時間內(nèi)毒素高濃度聚積，更加劇了外植體的褐化。

關(guān)鍵詞： 梨；砧木；中矮1號；褐化；防褐劑

文章編號：2096-8108（2023）03-0008-03 ?中圖分類號：S661.2 ?文獻標識碼：A

Study on Browning Inhibition in Vitro Culture of Dwarf Rootstock of ‘Zhongai 1

CUI ?Wenning，ZHU ?Shuxin，MENG ?Jingjing，WANG ?Can，WANG ?Qian，WANG ?Fangfang

（School of Life Science， Hengshui University， Hengshui 053000， China）

Abstract： 【Objective】Browning is a process of phenolic substances being oxidized into black-brown quinones， which is a key factor affecting the induction rate of callus in plant tissue culture. This experiment is conducted to study the inhibition effect of different types of anti-browning agents， and to solve the bottleneck problem for the subsequent in vitro rapid propagation research of ‘Zhongai 1. 【Methods】AgNO 3， activated carbon （AC）， Na 2S 2O 3， polyvinylpyrrodanone （PVP） and ascorbic acid （vitamin C） were used to prevent the browning of ‘Zhongai 1 leaves. 【Results】Compared with CK， browning control agent can effectively alleviate the browning of plants in tissue culture. Among them， VC had the best anti-browning effect， the browning rate was all less than 50.00%， and 0.05g/L VC had the best anti-browning effect with a lowest rate of 18.75%. 8.0 g/L PVP was the worst， the Browning rate was highest with a rate of 71.25%， and the medium was seriously stained， too. 【Conclusion】 The browning phenomenon is caused by multiple internal and external factors， including the genotype of explants， maternal age， sampling site， sampling time and size， etc. The accumulation of brown substance in the medium is also an important factor leading to the increase of the browning rate. Solid medium such as MS and 1/2MS is not conducive to the diffusion of toxic substances such as quinones. Moreover， it will lead to the accumulation of high concentration of endotoxin in a short time， which will aggravate the browning of explants.

Keywords： pear； rootstock; Zhongai 1; browning; anti-browning agent

‘中矮1號是中國農(nóng)科院果樹研究所從‘錦香梨的實生苗后代選育出來的第1代優(yōu)良矮化砧木，東方梨的栽培種親和性好，矮化作用明顯，大大促進了我國梨的矮砧密植栽培和設(shè)施化栽培的發(fā)展，具有巨大的社會效益。但其自根繁殖困難，離體組織擴繁是其有效的繁殖途徑之一。蘋果、梨等薔薇科植物多酚類物質(zhì)含量高，多酚氧化酶活性強，組織培養(yǎng)過程中外植體褐化現(xiàn)象嚴重，目前已有很多相關(guān)的研究報道 ?［1-3］ 。褐化是指在植物組織培養(yǎng)過程中，組織中的酚類物質(zhì)被氧化成黑褐色的醌類物質(zhì)的過程 ?［4］ 。褐化現(xiàn)象是影響植物組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導率的關(guān)鍵影響因素 ?［5］ ，雖然關(guān)于植物組培中褐化的研究很多，也取得了一些進展，但關(guān)于‘中矮1號離體組培的相關(guān)研究還未見報道。試驗以‘中矮1號葉片為試材，首次較系統(tǒng)的研究了不同類型的防褐劑對其抑制效果研究，擬為后續(xù)‘中矮1號的離體快繁研究解決瓶頸問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料選自河北省武邑縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)‘中矮1號梨砧木種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗方法

于2022年4月中旬清晨采集‘中矮1號中度成熟葉片（展葉15 d左右，綠色），放于500ml大燒杯中，帶回實驗室后用自來水流水沖洗，在不破損葉片的前提下，用軟毛牙刷輕輕刷掉葉片上的灰塵和小絨毛，然后流水沖洗1 h，隨后用1%的吐溫加洗衣粉水溶液完全浸泡葉片5～10 min，隨后再用自來水流水沖洗1 h，最后用0.1%的HgCl 2浸泡消毒10～15 min。

試驗采用單因素平行試驗設(shè)計。防褐劑選取AgNO 3（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、 0.3 mg/L 、 0.5 mg/L 、1.0 mg/L）、活性炭AC（0.05 g/L、0.1 g/L、 0.2 g/L 、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L）、Na 2S 2O 3（0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、 5.0 mg/L 、10.0 mg/L）、聚乙烯絡(luò)烷酮PVP（0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、 5.0 g/L 、8.0 g/L）、維生素C（0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L），設(shè)置不添加任何防褐劑處理做對照。消毒完畢的梨葉片剪成 1 cm 2 小塊接種于培養(yǎng)基上，每處理接種20瓶，每瓶4個外植體，3次重復。

所有試驗均采用MS培養(yǎng)基，于高壓滅菌鍋121℃高溫滅菌20 min，接種后每隔1 d同一時間統(tǒng)計葉片褐化情況，14 d后試驗結(jié)束。

褐化率=發(fā)生褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%，所得數(shù)據(jù)用Excell和DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO 3對褐化率的影響

接種1 d后外植體開始出現(xiàn)褐化，3 d后褐化增多，但褐化處表面無褐色物質(zhì)出現(xiàn)（詳細情況詳見表1）。14 d后統(tǒng)計褐化率可知，較低濃度的AgNO 3對‘中矮1號葉片的褐化抑制情況較明顯， 隨著AgNO 3濃度增加，褐化率增加。0.1 mg/L的處理防褐效果最好，葉片褐化率最低為22.50%， 1.0 mg/L 的處理褐化最嚴重，褐化率最高為47.50%。

2.2 AC對褐化率的影響

AC處理當天外植體即出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，3 d后褐化嚴重，褐化部位表面顏色加深，第7天時出現(xiàn)褐色物質(zhì)。由表2可知，14 d后0.2 g/L的AC對 ‘中矮1號葉片的防褐效果最好，褐化率為28.75%，表面無褐色物質(zhì)出現(xiàn)。其他處理組防褐效果依次為0.05 g/L>0.1 g/L> 0.3 g/L>0.5 g/L>1.0 g/L。

2.3 Na 2S 2O 3對褐化率的影響

接種當天開始出現(xiàn)褐化，第2天時褐化迅速加劇，第14天試驗結(jié)束時，大部分外植體褐化部位邊緣已出現(xiàn)褐色沉積物，培養(yǎng)基接觸部位已被浸染成黃褐色。由表3可知：所有Na 2S 2O 3處理的抗褐化效果都不算太好。相比來說，0.5 mg/L的處理組抗褐化效果最佳，為30.00%；10.0 mg/L的處理效果最差，高達61.25%。

2.4 PVP對褐化率的影響

PVP處理組接種當天即有部分出現(xiàn)褐化情況，第7天時1.0 g/L處理組外植體褐化邊緣出現(xiàn)褐色物質(zhì)沉積，14 d時有些已完全褐化、死亡。由表4可以看出，PVP的抗褐化效果隨著濃度的增加越來越差，0.5 g/L的PVP處理組抗褐化效果最佳，為25.00%；8.0 g/L的處理組效果最差，高達71.25%，且部分培養(yǎng)基已被嚴重褐化浸染。

2.5 維生素C對褐化率的影響

維生素C處理當天僅有少量外植體邊緣出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，第3天時褐化情況逐漸加劇，第14天試驗結(jié)束時，維生素C處理組的外植體褐化情況是最輕的。由表5可知：維生素C所有處理組的褐化率都在50.00%以內(nèi)，0.05 g/L的抗褐化效果是最好的，為18.75%，且沒有整個外植體完全褐化的現(xiàn)象；隨著維生素C濃度的增加，褐化逐漸嚴重。

2.6 CK的褐化率

不添加任何防褐劑的3個重復組褐化現(xiàn)象都很嚴重，接種當天即出現(xiàn)大部分褐變，第5天時大部分完全褐化死亡，第14天結(jié)束時，褐變率都在60.00%以上，最高可達76.25%，且大部分培養(yǎng)基受褐色物質(zhì)侵染。由此可見，防褐劑的添加對‘中矮1號葉片組培中的褐變抑制效果明顯。

3 結(jié)果與分析

褐化現(xiàn)象是薔薇科植物組織培養(yǎng)中常見問題，酚類物質(zhì)被氧化產(chǎn)生的醌類物質(zhì)會對外植體產(chǎn)生毒害作用，導致愈傷組織褐變并影響細胞代謝 ?［6］ ，所以，解決褐化問題是組培成功的關(guān)鍵。文曉鵬等 ?［7］ 在刺梨的愈傷組織誘導研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加一定濃度的AC可以有效控制刺梨褐化的產(chǎn)生；在本試驗中，添加了防褐劑處理的褐化情況都相比對照有所減輕，褐變時間和程度也有所延遲。 AgNO 3、AC和維生素C處理組的褐化率都在50.00%以內(nèi)，其中以維生素C 0.05 g/L的抗褐化效果是最好的，為18.75%，且沒有整個外植體完全褐化的現(xiàn)象，是最佳的防褐劑。本研究結(jié)果和高疆生 ?［8］ 在‘新梨7號組培快繁研究中的結(jié)果是一致的。

褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生有內(nèi)外多重因素，與外植體的基因型、母體年齡、取材部位、取材時間及大小等都有密切關(guān)系 ?［9］ 。另外，褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累也是導致外植體褐變率增加的一個重要因素 ?［10］ ，在本試驗中也是很明顯的一個褐變現(xiàn)象。MS和1/2MS等固體培養(yǎng)基不利于醌類等毒害物質(zhì)的擴散，導致其短時間內(nèi)毒素高濃度聚積，更加劇了外植體的褐化，所以，更換液體培養(yǎng)基的研究將會作為下一步工作的重點。

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參考文獻

［1］ ?陳 蕾，曹后男，宗成文，等.降低蘋果梨組織培養(yǎng)過程中外植體褐化的研究［J］.北方園藝，2008 （10）：139-142.

［2］ ?張 永慶，陳大明，金勇豐，等.桃離體組織分化再生植株的研究［J］.園藝學報，2001，28（4）：342- 344.

［3］ ?周 廣志，魯敏，安華明.刺梨果實發(fā)育過程中主要活性物質(zhì)含量及其抗氧化性分析［J］.食品科學，2018，39（22）：20-25.

［4］ ?王 森，謝碧霞.梨果肉褐變機理和防褐變技術(shù)的研究［J］.北方果樹，2004（5）：4-7.

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［7］ ?文 曉鵬.刺梨離體培養(yǎng)/遺傳多樣性分析及RGA克隆的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2003.

［8］ ?高 疆生，張衛(wèi)芳，歐勇慧，等，影響新梨7號組培快繁因子研究［J］.北方果樹，2003（3）：4-6.

［9］ ?謝 志亮，吳振旺.木本植物組培褐變研究進展［J］.中國南方果樹，2013，42（5）：42-46.

［10］ ?陳 蕾，曹后男，宗成文，等.降低蘋果梨組培過程中外植體褐化的研究［J］.北方園藝，2008（10）： 139-142.