趙子夜，汪昭明，高顯華，尹書怡，鄭建明，方瑞華，邢俊杰，王顥，張衛(wèi)，于恩達(dá)△

1 上海長(zhǎng)海醫(yī)院肛腸外科/遺傳性結(jié)直腸癌篩查防治中心 上海 200433

2 上海長(zhǎng)海醫(yī)院病理科 上海 200433

遺傳性結(jié)直腸癌綜合征是一類具有遺傳背景的結(jié)直腸癌。目前發(fā)現(xiàn)的遺傳性結(jié)直腸癌均為單基因遺傳病。在過(guò)去的20年里，醫(yī)學(xué)界對(duì)遺傳性結(jié)直腸癌綜合征，尤其是息肉病型遺傳性結(jié)直腸癌綜合征（即結(jié)腸息肉?。┑恼J(rèn)識(shí)和理解有了快速而廣泛的提高。結(jié)腸息肉病可根據(jù)息肉的病理性質(zhì)和數(shù)量進(jìn)行分類。若能明確致病或變異基因，則可獲得遺傳學(xué)診斷。美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)（American College of Gas?troenterology，ACG）指南明確了結(jié)腸息肉病的7種類型，并提供了具體的診斷和治療建議。這7中類型分別是家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous pol?yposis，F(xiàn)AP）、衰減型家族性腺瘤性息肉?。╝ttenu?ated familial adenomatous polyposis，AFAP）、MutYH相關(guān)息肉病（MutYH-associated polyposis，MAP）、黑斑息肉綜合征（Peutz–Jeghers syndrome，PJS）、幼年性息肉?。╦uvenile polyposis syndrome，JPS）[1]、PTEN錯(cuò)構(gòu)瘤腫瘤綜合征/Cowden 綜合征（PTENHamartoma Tumor Syndrome/Cowden syn?drome，PHTS/CS）及鋸齒狀息肉病綜合征（serrat?ed polyposis syndrome，SPS）[2]。隨著基因檢測(cè)和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)識(shí)別遺傳學(xué)改變對(duì)結(jié)腸息肉病進(jìn)行分型已經(jīng)成為可能并逐漸形成趨勢(shì)，這對(duì)遺傳咨詢、家系風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估大有幫助。

結(jié)腸腺瘤性息肉?。╟olorectal adenomatous pol?yposis，CAP）是最常見(jiàn)的結(jié)腸息肉病類型。MutYH（原名MYH）較早（2002年）被證實(shí)為CAP 的致病基因，由Al-Tassan 等[3]在英國(guó)威爾士地區(qū)的一個(gè)CAP家系中發(fā)現(xiàn)。此類CAP表型多為AFAP，在明確致病基因后命名為MAP，人類孟德?tīng)栠z傳在線（https://omim.org/）分類名為 FAP2 型（OMIM 608456），是一種常染色體隱性遺傳病。MutYH即mutY homolog，意為大腸桿菌腺嘌呤DNA 糖基化酶的同源基因，是DNA 修復(fù)途徑——堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）的成員之一。堿基切除修復(fù)途徑的另一個(gè)成員——NTHL1，也可導(dǎo)致CAP和結(jié)直腸癌[4]。MutYH功能缺失可引起基因組中特異性的G>T顛換[5]，由此可導(dǎo)致病理學(xué)及分子生物學(xué)方面一系列獨(dú)特的改變。目前已在MAP 和結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)了100 多種MutYH致病性變異（www.lovd.nl/MUTYH），相關(guān)病例大部分屬于歐美學(xué)者報(bào)道的高加索人種[6]。MAP 在東亞人群[7]中鮮有報(bào)道，其變異特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)及病理特征尚未得到全面描述。本研究基于本中心MAP 患者的臨床資料，分析基因變異及臨床病理特征，并部分呈現(xiàn)中國(guó)MAP 患者的臨床和遺傳學(xué)特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

上海長(zhǎng)海醫(yī)院遺傳性結(jié)直腸癌篩查防治中心登記有各類息肉病患者共500 多例。筆者團(tuán)隊(duì)于2020年12月對(duì)其中166 例CAP 患者進(jìn)行了結(jié)直腸癌相關(guān)致病基因胚系突變檢測(cè)。從醫(yī)院信息系統(tǒng)（hospital information system，HIS）獲取CAP 患者的臨床信息和家系信息，并通過(guò)隨訪補(bǔ)充部分信息?；颊咴谧≡夯螂S訪期間被招募進(jìn)入CAP 監(jiān)測(cè)及研究計(jì)劃，其結(jié)腸病變石蠟包埋標(biāo)本保存于長(zhǎng)海醫(yī)院病理科，患者及其親屬的外周血及口腔黏膜標(biāo)本于隨訪時(shí)獲取。所有患者在入院時(shí)均簽署知情同意書，并授權(quán)使用其臨床信息及生物標(biāo)本。此外，在隨訪期間補(bǔ)充采集的標(biāo)本也均獲得患者及其親屬的知情同意和書面授權(quán)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷為CAP 的患者且經(jīng)MutYH胚系變異檢測(cè)明確為MutYH基因雙等位基因變異攜帶者（純合變異或復(fù)合雜合變異），此類患者親屬若經(jīng)基因檢測(cè)證實(shí)為相同變異攜帶者（雙等位基因變異）也納入研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：生物樣本不能滿足檢測(cè)所需，拒絕參與研究，關(guān)鍵臨床信息缺失。

1.3 研究方法

采用動(dòng)物基因組DNA 提取試劑盒提取生物標(biāo)本的基因組DNA。采用Sanger 測(cè)序、下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）或多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplifica?tion，MLPA）等技術(shù)進(jìn)行MutYH變異檢測(cè)。NGS 及其涉及的DNA 提取、PCR 擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由上海鑒研生物技術(shù)公司完成。Sanger測(cè)序及其涉及的MutYH的16 個(gè)外顯子擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由上海邁浦生物技術(shù)公司完成，具體實(shí)驗(yàn)方法可參考文獻(xiàn)[8]。MutYH的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物見(jiàn)表1。

表1 MutYH基因外顯子擴(kuò)增及測(cè)序引物

對(duì)于NGS 未檢出致病變異的CAP 患者（即未發(fā)現(xiàn)APC致病變異及MutYH雙等位基因變異者），由病理科醫(yī)師復(fù)查病理切片結(jié)果，再次確認(rèn)其臨床診斷。非CAP 患者終止試驗(yàn)，確診為CAP 的患者繼續(xù)進(jìn)行APC及MutYH的MLPA 實(shí)驗(yàn)。MLPA 實(shí)驗(yàn)使用SALSA MLPA Probemix P043 APC 試劑盒，該試劑盒包含MutYH的第1、第2、第11、第16號(hào)外顯子檢測(cè)探針。由上海生工生物工程公司完成，具體實(shí)驗(yàn)方法可參考文獻(xiàn)[9]。使用coffalyser 軟件解讀結(jié)果（www.mlpa.com/coffalyser）。

1.4 臨床數(shù)據(jù)收集及指標(biāo)分析

本研究將攜帶MutYH雙等位基因變異（復(fù)合雜合變異/純合變異）的患者診斷為MAP，總結(jié)其Mu?tYH變異及臨床表型。根據(jù)息肉數(shù)量將CAP分為衰減型CAP（息肉數(shù)量10～99枚）和經(jīng)典型CAP（息肉數(shù)量≥100 枚），其中經(jīng)典型CAP 可進(jìn)一步分為稀疏型CAP（息肉數(shù)量100～1 000 枚）和密集型CAP（息肉數(shù)量>1 000 枚）。匯總分析患者的息肉/腫瘤病理結(jié)果，包括內(nèi)鏡切除標(biāo)本和手術(shù)標(biāo)本的病理性質(zhì)、錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白表達(dá)情況（錯(cuò)配修復(fù)功能完整或缺失），以及KRAS基因突變情況。其中，MMR 蛋白完整表達(dá)稱為錯(cuò)配修復(fù)完整（MMR proficient，pMMR），MMR蛋白表達(dá)缺失稱為錯(cuò)配修復(fù)缺陷（MMR deficient，dMMR）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以M（QL，QU）表示；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示。

2 結(jié)果

2.1 變異檢測(cè)及致病性分析

在166 例CAP 患者中，10 例患者攜帶MutYH雙等位基因變異，修正診斷為MAP。在這10 例攜帶MutYH雙等位基因變異的患者中，有2例患者屬于同一家系（MAP-2），共確認(rèn)了9 個(gè)MAP 家系，見(jiàn)圖1（MAP-6/7 無(wú)詳細(xì)家系信息）。僅MAP-5 家系為純合變異，其余均為復(fù)合雜合變異。其中6 個(gè)家系（MAP-1/2/3/4/5/7）中的8種變異（c.55C>T、c.799C>T、c.467G>A、 c.1435G>T、 c.733C>T、 c.1187G>A、c.857G>A、c.1214C>T）已被報(bào)道，另外5 種變異（c.307T>G、 c.1047G>A、 del exon2、 del exon11、del exon16）在數(shù)據(jù)庫(kù)（dbSNP，ClinVar，ExAC，HG?MD，LOVD）中未見(jiàn)報(bào)道或記錄，4種變異（c.55C>T、c.799C>T、c.857G>A、del exon2）在本隊(duì)列中重復(fù)檢出（表2）。上述13種變異中，10種為點(diǎn)突變/單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV），3 種為大片段缺失，屬于拷貝數(shù)變異（copy number varia?tion，CNV）。SNV 中的5 種無(wú)義變異（c.55C>T、c.467G>A、c.799C>T、c.1047G>A、c.1435G>T）和3種CNV（del exon2、del exon11、del exon16）均可導(dǎo)致MutYH蛋白截短或降解，可直接判定為致病變異。c.1187G>A是最早發(fā)現(xiàn)于高加索人種中的始祖變異，且在歐洲MAP 患者中多次檢出，可判定為致病變異[10]。另外4 種錯(cuò)義變異（c.307T>G、c.733C>T、c.857G>A、c.1214C>T）會(huì)導(dǎo)致單個(gè)氨基酸的替換，根據(jù)PolyPhen-2工具（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）預(yù)測(cè)均可導(dǎo)致顯著的功能改變（圖2）。綜合人群（不可用）、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)（相同氨基酸改變已被證實(shí)為致病變異/PS1）、功能學(xué)（不可用）、分離（與MAP表型共分離/PP1）、新發(fā)變異（不可用）、其他信息（患者表型高度特異/PP4）等數(shù)據(jù)分析致病性，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（Ameri?can College of Medical Genetics and Genomics，AC?MG）標(biāo)準(zhǔn)[11]最終判定上述4 種錯(cuò)義突變均為可能致病變異（1PS+2PP）。

圖1 MAP家系圖

表2 先證者所攜帶的MutYH基因變異

2.2 臨床表現(xiàn)

10例MAP患者分屬9個(gè)獨(dú)立家系，除MAP-5家系存在近親結(jié)婚且為MutYH純合變異外，其余8個(gè)家系中未發(fā)現(xiàn)近親結(jié)婚，致病變異為復(fù)合雜合變異（圖1）。10例MAP患者中，有6例結(jié)腸息肉數(shù)量不足100 枚，屬于衰減型CAP；其余4 例息肉數(shù)量大于100 枚，但不足1 000 枚，屬于經(jīng)典型（稀疏型）CAP（圖3A、圖3B），病理證實(shí)均為腺瘤（圖4A、圖4B）。1 例患者罹患胃息肉?。∕AP-7 1）（圖3C）。這10例MAP患者接受治療時(shí)，6例已發(fā)生結(jié)直腸癌（圖3D、圖4C），1例發(fā)生腺瘤高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（表3）。6例結(jié)直腸癌患者中的5例術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行了KRAS基因檢測(cè)和免疫組化實(shí)驗(yàn)，其中4 例為KRAS突變型，2 例為dMMR。10 例患者中，1 例始終采取結(jié)腸鏡治療；9 例接受外科手術(shù)治療（其中1人接受兩次手術(shù)），其中3 例接受全大腸切除術(shù)（2例回腸儲(chǔ)袋肛管吻合、1例回腸造口術(shù)）（圖3E、圖3F），5例接受全結(jié)腸切除術(shù)（回腸直腸吻合），1例接受次全大腸切除術(shù)（升結(jié)腸肛管吻合）。1例患者術(shù)后15個(gè)月死于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移（MAP-8 Ⅱ:1）。10例MAP 患者的中位發(fā)病年齡為42（27，62）歲，中位治療年齡為48（31，62）歲。發(fā)生癌變的6 例MAP患者中，經(jīng)典型CAP 和衰減型CAP 各3 例，治療年齡分別為41 歲、43 歲、58 歲，31 歲、48 歲、62歲。MAP-2 家系中的2 例患者均從42 歲開(kāi)始內(nèi)鏡監(jiān)測(cè)，癌變者手術(shù)時(shí)年齡為48 歲，未癌變者手術(shù)時(shí)年齡為53歲（表3）。

圖3 部分MAP患者的內(nèi)鏡圖

圖4 部分MAP患者的病理結(jié)果圖

表3 MAP患者的表型特征

表3（續(xù)）

3 討論

根據(jù)致病基因的不同，CAP 可分為APC相關(guān)息肉?。ˋPC-associated polyposis，AAP）、MAP、AX?IN2相關(guān)CAP、聚合酶校對(duì)相關(guān)息肉?。╬olymerase proofreading associated polyposis，PPAP）及結(jié)構(gòu)性錯(cuò)配修復(fù)缺陷綜合征（constitutional mismatch re?pair deficiency syndrome，CMMRD）[12]。由于臨床診斷時(shí)通常不能獲得基因檢測(cè)結(jié)果，CAP 既往幾乎均被診斷為FAP，暗示著APC是最可能的致病基因，其在CAP患者中的檢出率為70%～90%。隨著CAP患者數(shù)量的增加，越來(lái)越多的CAP 患者被發(fā)現(xiàn)不攜帶APC基因變異，而發(fā)現(xiàn)了其他CAP 相關(guān)基因。本研究在166 例CAP 患者中鑒定到10 例MAP 患者，分屬9個(gè)獨(dú)立家系。經(jīng)典型CAP患者4例，衰減型CAP患者6 例。這10 例患者的中位發(fā)病年齡為42 歲，平均發(fā)病年齡為48 歲，診斷時(shí)癌變比例為6/10，均與文獻(xiàn)報(bào)道相似[13]。MAP患者腫瘤的KRAS突變型比例為4/5，dMMR 也存在（2/5）。在9 個(gè)家系18 個(gè)MutYH變異中有非重復(fù)變異13 種，其中5 種未見(jiàn)于既往報(bào)道，且有大片段缺失CNV 3種。既往應(yīng)用MLPA檢測(cè)MutYH的CNV僅見(jiàn)于兩項(xiàng)研究[14-15]，本研究結(jié)果提示該基因CNV 存在的客觀性，尤其對(duì)于SNV 檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)致病變異者，一定要完善CNV 檢測(cè)以避免得出假陰性結(jié)論。

由結(jié)腸息肉病綜合征導(dǎo)致的結(jié)直腸癌僅占1%～3%，且不同CAP 在臨床表現(xiàn)上并不存在明確界線而是相互混雜，因此目前無(wú)法僅憑臨床表現(xiàn)確診一種CAP，這一情況在無(wú)家族史的患者中尤其明顯。對(duì)MAP 這類隱性遺傳病而言，可能引起混雜的因素至少包括以下兩個(gè)：（1）罕見(jiàn)的跨世代家族史；（2）息肉數(shù)量極少以致不能引起醫(yī)師對(duì)CAP 的懷疑。MAP 總體上具有息肉數(shù)量較少、發(fā)病時(shí)間較晚、腸外表現(xiàn)不鮮明的特點(diǎn)，因此現(xiàn)階段確診MAP 的時(shí)間總體上是落后的，很多患者確診時(shí)已有癌變。在基因診斷方法改進(jìn)和介入時(shí)機(jī)恰當(dāng)選擇上進(jìn)行嘗試是提升MAP 診療效果的必由之路。同時(shí)，結(jié)合在散發(fā)性結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)MutYH雙等位基因變異的事實(shí)綜合分析，一旦實(shí)現(xiàn)早期診斷，極有可能面對(duì)MAP 表型進(jìn)一步復(fù)雜化的情況，尤其當(dāng)面對(duì)未生長(zhǎng)結(jié)腸息肉或息肉數(shù)量極少而不能達(dá)成CAP 診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要考慮對(duì)MAP 進(jìn)行重新定義，類似于BMPR1A相關(guān)息肉病的情況[16]。

MutYH作為一種BER 基因，其蛋白產(chǎn)物可以修復(fù)DNA的特定氧化損傷，降低DNA復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤概率[17]。因?yàn)镸utYH有多種轉(zhuǎn)錄本及蛋白異構(gòu)體，所以在識(shí)別該基因變異的歷程中經(jīng)歷過(guò)若干次參考序列的改變，當(dāng)前參考轉(zhuǎn)錄本為NM_001128425，包含氨基酸殘基549個(gè)，對(duì)早期文獻(xiàn)報(bào)道及數(shù)據(jù)庫(kù)記錄的變異應(yīng)注意對(duì)序列差異的識(shí)別。p.Y179C 和p.G396D在高加索人種MutYH變異中約占80%[6]，被認(rèn)為是歐洲的“始祖變異”。Aretz等[18]專門對(duì)這兩個(gè)變異的發(fā)生時(shí)間進(jìn)行推算，得出這兩個(gè)變異分別出現(xiàn)于約305世代和350世代之前，即公元前8 000—4 000年的新石器時(shí)代。有關(guān)MAP的早期文獻(xiàn)和部分地區(qū)的報(bào)告中存在著較高比例的純合變異患者（6/7和13/13）[19-20]，這與本研究隊(duì)列顯著不同（1/9），其中的重要原因在于我國(guó)的計(jì)劃生育制度很大程度避免了近親結(jié)婚的出現(xiàn)。因?yàn)橐汛_診的MAP 患者數(shù)量有限，其基因型—表現(xiàn)型相關(guān)性分析較難開(kāi)展。來(lái)自英國(guó)加迪夫大學(xué)、德國(guó)波恩大學(xué)和荷蘭萊頓大學(xué)的數(shù)據(jù)共匯總了257 例MAP 患者信息用于相關(guān)性分析，得到的核心結(jié)論是p.Y179C導(dǎo)致臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重而p.G396D相對(duì)較輕，臨床現(xiàn)象與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[21]。但上述結(jié)論的意義相對(duì)有限，僅能對(duì)攜帶上述“始祖變異”的個(gè)體提供預(yù)測(cè)信息，對(duì)其他族群或其他變異攜帶者并不具有參考價(jià)值。再分析腸外表現(xiàn)時(shí)病例數(shù)增加到了276例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)十二指腸腺瘤最為常見(jiàn)，發(fā)生率為17%～34%[22]。本研究?jī)H1例患者在胃鏡檢查中發(fā)現(xiàn)胃息肉病，說(shuō)明我們?cè)谂R床實(shí)踐中對(duì)此類患者上消化道的監(jiān)測(cè)較為薄弱。研究數(shù)據(jù)還提示MAP 患者的膀胱癌、卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)有所增加，值得進(jìn)一步關(guān)注。

隱性遺傳病致病變異往往以一定的比例廣泛存在于人群中，且具有人群特異性。歐美國(guó)家的數(shù)據(jù)表明，MutYH雜合變異攜帶者在無(wú)癥狀人群中的比例為1%～2%，按照隱性遺傳病發(fā)生率粗略計(jì)算方法推斷，MAP 的自然發(fā)生率為（2.5～10）/10 萬(wàn)。MutYH變異雜合攜帶者雖然不會(huì)發(fā)展為CAP，但其罹患結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)也有所增加[23]。美國(guó)、加拿大、澳大利亞的結(jié)直腸癌匯總數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌患者攜帶MutYH雜合變異的比例高達(dá)1/45[24]，這表明散發(fā)以及無(wú)息肉病表現(xiàn)的結(jié)直腸癌患者中存在著相當(dāng)數(shù)量的MutYH變異攜帶者，那么Mu?tYH變異所導(dǎo)致的特異性病理學(xué)及分子生物學(xué)特征對(duì)于識(shí)別此類患者具有重要的價(jià)值。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MAP 患者除發(fā)生結(jié)腸腺瘤外，可能同時(shí)存在增生性息肉和鋸齒狀病變（息肉/腺瘤）[25]。鋸齒狀病變的特點(diǎn)是不經(jīng)過(guò)經(jīng)典腺瘤癌變途徑而發(fā)生癌變，可伴隨BRAF突變、KRAS突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等特征。另一方面由于MutYH功能缺失會(huì)導(dǎo)致基因組內(nèi)大量G>T 顛換，導(dǎo)致MAP 相關(guān)結(jié)直腸癌具有較高比例的KRAS突變發(fā)生，也可以導(dǎo)致MMR 基因的變異繼而引起dMMR腫瘤的發(fā)生。Lynch綜合征在結(jié)直腸癌中占比約為3%，與此同時(shí)，具有dMMR表現(xiàn)卻無(wú)相應(yīng)MMR 基因及其相關(guān)基因胚系變異的Lynch 樣綜合征占比也接近3%，其中部分患者可檢測(cè)到MutYH雙等位基因胚系突變[14]。上述現(xiàn)象存在廣泛重疊，其深層次原因值得進(jìn)一步研究。現(xiàn)階段臨床實(shí)踐中需要注意：（1）加強(qiáng)KRAS突變型結(jié)直腸癌患者的MutYH胚系突變檢測(cè)；（2）dMMR不是排除MutYH胚系突變的標(biāo)準(zhǔn)。

本研究的不足之處主要有以下兩點(diǎn)：（1）樣本量太小以至于不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。雖然研究呈現(xiàn)出了息肉病表型與癌變比例無(wú)顯著相關(guān)、腫瘤KRAS突變型比例高（4/5）、dMMR比例低（2/5）等與既往研究接近的結(jié)果，但不能獲得統(tǒng)計(jì)推斷的佐證。（2）沒(méi)有進(jìn)行非息肉病結(jié)直腸癌患者的MutYH胚系檢測(cè)，從而不能進(jìn)行兩組間的對(duì)比，不能獲得進(jìn)一步的基因型—表現(xiàn)型數(shù)據(jù)。以上缺陷值得進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)或進(jìn)行多中心研究來(lái)獲得更可信、更有價(jià)值的結(jié)果。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。