曹功澤

（中國石化勝利油田分公司石油工程技術(shù)研究院，山東 東營 257000）

0 引 言

微生物采油技術(shù)是從注水井注入微生物或營養(yǎng)液，利用激活后驅(qū)油功能微生物的生長活動(dòng)和代謝產(chǎn)物與油藏巖石、流體作用，改善流體滲流特征，提高原油采收率的技術(shù)[1‐2］，該技術(shù)與其他三次采油技術(shù)相比，具有成本低、綠色環(huán)保、工藝簡單等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，近幾年成為提高油藏采收率的研究熱點(diǎn)。油藏環(huán)境中存在不同種類的微生物，微生物通過物質(zhì)和能量代謝相互作用，形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，是微生物采油技術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同類型油藏由于環(huán)境的差異及開發(fā)方式的不同會(huì)造成微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。微生物群落的差異勢(shì)必影響后續(xù)激活劑的篩選和作用效果的評(píng)價(jià)。因此，針對(duì)不同類型油藏進(jìn)行內(nèi)源微生物群落分析，明確不同類型油藏微生物群落特征，確定其主要驅(qū)油功能菌，進(jìn)而針對(duì)性地制定功能微生物定向激活策略，實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)不同類型油藏原油的高效作用，將對(duì)不同類型油藏微生物提高采收率技術(shù)的應(yīng)用效果產(chǎn)生重大影響[3‐4］。

水驅(qū)和聚合物驅(qū)是勝利油田開發(fā)的2 種主要驅(qū)替技術(shù)，水驅(qū)和聚合物驅(qū)過程中驅(qū)替介質(zhì)會(huì)對(duì)原始地層中的微生物群落產(chǎn)生影響。本文以勝利油田水驅(qū)油藏、聚合物驅(qū)油藏、聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏為研究對(duì)象，開展油井產(chǎn)出液微生物群落多樣性及功能菌特征分析，對(duì)比分析不同油藏中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，明確不同油藏微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為微生物采油技術(shù)的現(xiàn)場應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 油藏基礎(chǔ)參數(shù)

以勝利油田孤島油田和孤東油田為主要分析對(duì)象，選取了2 個(gè)油田聚合物驅(qū)、聚合物驅(qū)后水驅(qū)、水驅(qū)的14 口油井開展取樣分析（表1），取樣油井開發(fā)時(shí)間均超過5 a。通過16S 高通量測(cè)序解析不同樣品中的內(nèi)源微生物群落特征信息，進(jìn)一步總結(jié)不同開發(fā)方式油藏中的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。所選取研究區(qū)塊的油藏溫度為50~71 ℃，地下原油黏度為92~290 mPa·s，油藏滲透率為788×10?3~5 890×10?3μm2，孔隙度為33.5%~37.9%，所有區(qū)塊都處于高含水階段，綜合平均含水率超過95.0%，平均采出程度均在40.00%以上，符合微生物驅(qū)油技術(shù)規(guī)范所規(guī)定的微生物驅(qū)油油藏篩選標(biāo)準(zhǔn)[5］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 油井產(chǎn)出液取樣

取樣油井的選擇是以試驗(yàn)區(qū)塊為單元，每個(gè)區(qū)塊選取中心井1 口，邊部井1 口，保證樣品能夠代表區(qū)塊的微生物群落特點(diǎn)。所有油井樣品采用井口取樣，取樣過程中為保證樣品不被污染，利用10 L的無菌取樣桶進(jìn)行產(chǎn)出液樣品的采集，取樣前需將管線中的流體排放干凈后再取樣。由于油藏屬于中高溫油藏，原始油藏微生物濃度為102~103個(gè)/mL，每個(gè)樣品取樣量大于5 L，保證水相中的微生物量滿足后續(xù)DNA 的提取及測(cè)序的要求。所有樣品取樣后需盡快運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，待油水分離后盡快開展微生物收集及DNA 提取。

樣品編號(hào)W.L 為水驅(qū)樣品；ZJ.L 為聚合物驅(qū)樣品；ZJW.L 為聚合物驅(qū)后水驅(qū)樣品。

2.2 油井產(chǎn)出液離子組成

油井產(chǎn)出液離子組成分析參照中華人民共和國石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T 5523—2016《油田水分析方法》，其中鈣、鎂的測(cè)定是利用EDTA 滴定法，碳酸氫根是利用鹽酸滴定法，氯離子是利用硝酸汞滴定法，硫酸根是利用鉻酸鋇分光光度法，鉀、鈉離子是利用原子吸收分光光度法，pH 的測(cè)定是用上海精密科技儀器有限公司的PHS‐3B 型pH 計(jì)。

2.3 油井產(chǎn)出液微生物收集及DNA提取

采用離心法收集油井樣品中的微生物，每個(gè)樣品離心3 L，離心使用Beckman 公司的J6 型大容量冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，30 min，離心后小心棄去上層水相和油相，收集下層微生物菌體沉淀。樣品微生物DNA 的提取采用Axygen 公司的AxyPrep DNA 提取試劑盒，具體操作過程參照試劑盒說明，提取的DNA 最終溶在100 μL TE 緩沖液中，利用NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，確保DNA 樣品足量，OD260/OD280為1.6~1.8，滿足后續(xù)高通量測(cè)序要求。DNA 樣品提取后置于?70 ℃保存，防止樣品降解[6］。

2.4 微生物群落高通量測(cè)序分析

細(xì)菌16S rRNA 基因V4 區(qū)擴(kuò)增及高通量測(cè)序委托深圳華大基因公司進(jìn)行，具體方法見參考文獻(xiàn)[7‐8］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 油井產(chǎn)出液性質(zhì)

對(duì)不同開發(fā)方式的14 口取樣井的產(chǎn)出液離子組成、總礦化度和pH 進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，不同油井總礦化度為6 752~11 665 mg/L，pH 為7.05~8.07（中性）（表2）。取樣油井地層水性質(zhì)符合微生物采油油藏篩選標(biāo)準(zhǔn)[5］，適合開展微生物采油技術(shù)。

表2 不同類型油藏單井產(chǎn)出液離子組成和pHTable 2 Ion composition and pH of single well produced fluid in different types of reservoirs

3.2 產(chǎn)出液樣品DNA測(cè)序結(jié)果

從14 口油井產(chǎn)出液中提取微生物群落的總DNA，所有樣品的DNA 經(jīng)過檢測(cè)OD260/OD280為1.6~1.8，質(zhì)量濃度為2.0 ~25.7 mg/L。所有樣品DNA 的質(zhì)量濃度和純度經(jīng)華大基因測(cè)序部質(zhì)控檢測(cè)均達(dá)到建庫測(cè)序的要求。圖1 為測(cè)序稀釋曲線，從圖中1可以看出所有樣品的稀釋曲線末端趨于平緩，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度覆蓋95%以上的微生物種類，能夠滿足微生物群落分析要求，而且水驅(qū)油藏油井樣品中解析到的微生物種類數(shù)量明顯高于聚合物驅(qū)和聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏樣品。

圖1 所有樣品的測(cè)序稀釋曲線Fig. 1 Sequencing dilution curves of all samples

3.3 不同樣品群落組成

通過高通量數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)解析，得到不同樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息，分別從門和屬水平上進(jìn)行討論。門水平上，不同油藏樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌都屬于變形菌門（Proteobacteria）（圖2（a）），這也是油藏微生物的主要類群。屬水平上，不同油藏產(chǎn)出液中均存在大量未解析菌屬，從已解析的菌屬信息分析，不同油藏的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的差異，與前期的報(bào)道結(jié)論吻合[9‐10］。圖2（b）中水驅(qū)油藏中的優(yōu)勢(shì)微生物種類是假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、Alicycliphilussp.、Tepidiphilussp.、Parvibaculumsp.、海細(xì)菌屬（Marinobacteriumsp.）和嗜鹽單胞菌屬（Halomonassp.）等，上述菌種普遍存在于水驅(qū)稠油油藏環(huán)境中[11］。其中假單胞菌屬是常用的采油功能菌，具有產(chǎn)生物表面活性劑及嗜烴的功能[12］，Alicycliphilussp.是一類可以降解有機(jī)污染物的脫氮菌[13］，Marinobacteriumsp.具 有 嗜 烴 降 黏 的 功能[14］。從群落結(jié)構(gòu)組成分析，水驅(qū)油藏區(qū)塊都具備實(shí)施內(nèi)源微生物驅(qū)油的潛力[15］。與水驅(qū)油藏微生物種類相比，聚合物驅(qū)油藏和聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏解析到的微生物種類明顯減少，但優(yōu)勢(shì)性顯著增加，其中假單胞菌屬占到了總?cè)郝涞?0%以上[16‐17］。此外，聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏中Alicycliphilussp.、陶厄氏菌屬（Thauerasp.）是主要優(yōu)勢(shì)菌，這兩株菌具有脫氮、反硝化功能、嗜烴的作用[18‐19］，優(yōu)勢(shì)性增加與注入的聚合物有關(guān)，聚合物結(jié)構(gòu)中含有酰胺基等官能團(tuán)，具有脫氮功能的微生物可以利用聚合物作為營養(yǎng)物生長。聚合物驅(qū)油藏中除了具有聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏所包含的優(yōu)勢(shì)菌以外，還含有弓形菌屬（Arcobactersp.）、Pannonibactersp.等優(yōu)勢(shì)菌屬，其中弓形菌屬和脫鐵桿菌屬是勝利油田油藏中常見的菌屬；Pannonibacter是一種與鉻吸附礦化相關(guān)的菌[20］，該菌的出現(xiàn)與鉻交聯(lián)注劑有關(guān)，這種菌在聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏中也存在，但優(yōu)勢(shì)度下降，在水驅(qū)油藏中未發(fā)現(xiàn)該菌，此類菌是注聚油藏所特有的微生物種群。

圖2 不同油藏中的微生物群落種類Fig. 2 Microbial communities in different types of reservoirs

3.4 不同樣品聚類

通過聚類分析進(jìn)一步明確不同油藏微生物群落間的關(guān)系，從圖3（a）可以得出相同開發(fā)方式的油井樣品傾向于聚類在一起，如聚合物驅(qū)的6#油井和2#、3#油井聚類在一起。水驅(qū)油藏樣品與其他兩類樣品距離遠(yuǎn)，聚合物驅(qū)和聚合物驅(qū)后水驅(qū)的油井聚類存在交叉，聚合物驅(qū)的4#油井與聚合物驅(qū)后水驅(qū)的9#油井聚在一支。

圖3 不同樣品聚類分析和油井交叉聚類群落相似性Fig. 3 Cluster analysis of different samples and cross cluster community similarity of producers

從群落結(jié)構(gòu)上看（圖3（b）），假單胞菌屬和pannonibactersp.是4#和9#油井共有的優(yōu)勢(shì)菌，其中pannonibactersp.是聚合物驅(qū)油井所特有的微生物類群。以上結(jié)果進(jìn)一步證明油藏微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著驅(qū)替介質(zhì)的改變發(fā)生不同的變化，驅(qū)替介質(zhì)的改變會(huì)使微生物群落產(chǎn)生選擇壓力。此結(jié)果也為不同油藏的微生物分析評(píng)價(jià)及激活培養(yǎng)提供了可靠參考，可以指導(dǎo)不同油藏微生物驅(qū)油的激活方向和調(diào)控目標(biāo)。

3.5 不同油藏微生物群落多樣性

通過對(duì)比不同油藏樣品微生物群落辛普森指數(shù)（圖4），證實(shí)水驅(qū)油藏的微生物群落多樣性最高，聚合物驅(qū)油藏微生物多樣性次之，聚合物驅(qū)后水驅(qū)油藏的微生物群落多樣性最低。分析主要原因是水驅(qū)油藏中缺乏外界選擇壓力，通過長期水驅(qū)后，不同種類的微生物適應(yīng)了該環(huán)境。聚合物驅(qū)油藏微生物群落多樣性降低，是由于注入聚合物后對(duì)油藏內(nèi)部微生物產(chǎn)生了選擇壓力，部分微生物無法耐受聚合物，比例快速降低，同時(shí)一些專性代謝聚合物的微生物優(yōu)勢(shì)度逐漸增加成為其中的優(yōu)勢(shì)菌，但整個(gè)菌群多樣性降低[21‐22］。聚合物驅(qū)后水驅(qū)的油藏微生物群落多樣性最低，和后續(xù)水驅(qū)與前期的注聚交替形成了對(duì)微生物的過程調(diào)控作用有關(guān)。胡婧等[7］利用長巖心連續(xù)動(dòng)態(tài)驅(qū)替實(shí)驗(yàn)研究了不同輪次的激活劑注入對(duì)微生物群落的影響，證明激活劑的交替注入會(huì)進(jìn)一步降低菌群多樣性。此結(jié)論與現(xiàn)場油藏微生物群落多樣變化相符。

圖4 不同樣品辛普森指數(shù)箱形圖Fig. 4 Box plot of Simpson index for different samples

3.6 溫度對(duì)油藏微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

油藏溫度對(duì)油藏微生物具有明顯的影響，以聚合物驅(qū)油藏為例，采樣油井共6 口，其中2 口油井油藏溫度53 ℃，剩下4 口油井油藏溫度為69~71 ℃，從多樣性分析來看，隨著溫度的升高，油藏微生物多樣性明顯降低，部分對(duì)溫度敏感的微生物無法在不同溫度的油藏中廣泛分布。

從圖5 中分類菌分析得出，53 ℃油藏中的Pannonibactersp.和陶厄氏菌屬微生物在69、71 ℃的豐度降低，假單胞菌屬和弓形桿菌屬是所有溫度油藏樣品中的優(yōu)勢(shì)菌。由于此次取樣油藏溫度范圍沒有明顯的梯度，溫度范圍窄，從菌群結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)菌看不出溫度對(duì)群落的明顯影響，后期需針對(duì)不同溫度油藏開展專門的研究，明確溫度對(duì)油藏微生物群落的具體影響。

4 結(jié) 論

（1）油藏樣品中內(nèi)源微生物群落優(yōu)勢(shì)細(xì)菌都屬于變形菌門，這是油藏微生物的主要類群，屬水平上共有的主要菌屬是假單胞菌，該類菌是勝利油田油藏中分布最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的采油功能菌。

（2）水驅(qū)油藏微生物群落多樣性高，種類豐富，無明顯的優(yōu)勢(shì)菌；注聚合物后油藏微生物群落存在明顯變化，多樣性降低，但一些專性代謝聚合物的微生物優(yōu)勢(shì)度逐漸增加，成為油藏中的優(yōu)勢(shì)菌。

（3）不同油藏微生物群落及功能菌存在明顯差異，需依據(jù)其特有的微生物特點(diǎn)制定不同的激活策略，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)微生物采油的現(xiàn)場應(yīng)用。