陳薇薇 幸寧

摘要 ［目的］開發(fā)雪膽屬表達(dá)序列標(biāo)簽簡單重復(fù)序列（SSR）分子標(biāo)記。［方法］對雪膽屬肉花雪膽和母豬雪膽2個(gè)種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，檢測SSR位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢驗(yàn)引物的有效性和多態(tài)性，并分析種間和種內(nèi)遺傳多樣性。［結(jié)果］從200對引物中篩選出6對具有高多態(tài)性的引物，每對引物檢測到的等位基因數(shù)5～8個(gè)，平均值6.333 3個(gè)。有效等位基因（Ne）為2.480 7～4.982 8個(gè)，平均值3.760 8個(gè)。多態(tài)信息含量（PIC）為0.549 5～0.758 3，平均值0.672 9。遺傳多樣性分析顯示，種間和種內(nèi)居群均存在明顯的遺傳分化。［結(jié)論］該研究開發(fā)的EST-SSR引物具有豐富的多態(tài)性，為雪膽屬植物的遺傳多樣性研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 雪膽屬；轉(zhuǎn)錄組；EST-SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號 R28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2023）09-0160-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.039

Abstract ［Objective］To develop SSR molecular markers in Hemsleya.［Method］Tow species of H. carnosiflora and H. villosipetala were RNA sequenced. SSR loci were detected and primers were designed，the validity and polymorphism of primers were detected by PCR amplification and capillary electrophoresis. The interspecific and intraspecific genetic diversity was analyzed. ［Result］ 6 pairs of primers with high polymorphism were selected form 200 pairs of primers.The number of alleles detected by each pair of primers was 5-8， with an average of 6.333 3. The effective alleles （Ne） was 2.480 7-4.982 8， with an average of 3.760 8. The polymorphic information content （PIC） was 0.549 5-0.758 3， with an average of 0.672 9. Genetic diversity analysis showed that there were obvious genetic differentiation in interspecific and intraspecific populations. ［Conclusion］The ESTSSR primers developed in this study have rich polymorphism， which can provide reference basis for the study of genetic diversity of Hemsleya.

Key words Hemsleya;Transcriptome;ESTSSR molecular marker;Genetic diversity

基金項(xiàng)目 貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合 LH 字〔2017〕7053號）； 貴州省教育廳青年科技人才成長項(xiàng)目（黔教合KY字〔2018〕324號）。

作者簡介 陳薇薇（1982—），女，四川資中人，講師，碩士，從事資源植物保護(hù)與利用研究。

雪膽屬（Hemsleya）隸屬葫蘆科（Cucurbitaceae），該屬植物均為多年生草本植物，屬下共31種10變種［1］，西南地區(qū)為該屬植物的主要分布區(qū)，其中貴州地區(qū)分布約6種。雪膽屬植物多可入藥，藥用部位為干燥塊莖，有極高的藥用價(jià)值，從該屬植物中分離出的雪膽素載入1977年版《中國藥典》一部［2］，該屬植物也是我國西南地區(qū)各民族常用的傳統(tǒng)中草藥?，F(xiàn)代研究表明，其主要活性成分包括葫蘆烷型四環(huán)三萜及其皂苷和齊墩果烷型五環(huán)三萜及其皂苷等，顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤與抗菌消炎作用［3-4］，而近年的試驗(yàn)中更是顯示出了抗 HIV-1的活性［5］。由于分布范圍窄，野生資源有限，受人為過度采集的影響，雪膽屬植物野生資源急劇減少，對雪膽屬植物野生居群的保護(hù)和人工馴化迫在眉睫。

SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記即簡單重復(fù)序列標(biāo)記，是以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)［6］，具有高多態(tài)性、信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建、品種鑒定、譜系分析、群體間遺傳距離分析、進(jìn)化和遺傳多樣性等研究中［7］，主要包括基因組SSR和表達(dá)序列SSR。其中表達(dá)序列標(biāo)簽（experssed sequence tags，EST）SSR來自相對保守的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，能夠直接獲得基因表達(dá)的信息，同時(shí)在近緣和遠(yuǎn)緣物種間的通用性都較好［8-9］。雪膽屬SSR標(biāo)記開發(fā)滯后，目前僅見葫蘆科甜瓜、黃瓜和西瓜等不同瓜類作物間有一定的通用性的引物報(bào)道［10-11］。因此，該研究對貴州藥材市場主流的雪膽藥材基源植物肉花雪膽（Hemsleya carnosiflora）、母豬雪膽（Hemsleya villosipetala）共17個(gè)居群進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析，開發(fā)EST-SSR分子標(biāo)記，以期為雪膽屬植物的種質(zhì)資源保護(hù)和分子標(biāo)記輔助選育等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

該研究使用的雪膽屬種質(zhì)資源共17份（表1），采集于貴州省不同地區(qū)，采集時(shí)間為2018—2021年每年7—8月，樣品按照居群采樣，同時(shí)為避免居群內(nèi)個(gè)體重復(fù)取樣，個(gè)體均采集于不同樣地，各樣地相距20 m以上。野外及時(shí)采集樣品新鮮嫩葉，于硅膠中干燥待用，并將樣品塊莖帶回，種植于安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)地內(nèi)。2021年5月，采集實(shí)驗(yàn)地內(nèi)處于營養(yǎng)生長期的肉花雪膽和母豬雪膽2個(gè)種質(zhì)的植株幼葉，液氮冷凍30 min后，放入-80 ℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取。

采用TSINGKE植物基因組DNA試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，紫外分光光度法檢測DNA的質(zhì)量濃度，最后稀釋標(biāo)定到20 ng/μL，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物來源與篩選。

采用TSINGKE植物RNA提取試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）提取RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的質(zhì)量。將RNA送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序的生物信息學(xué)分析得到的SSR位點(diǎn)引物信息，利用MISA程序搜尋SSR位點(diǎn)，選擇重復(fù)單元為2、3、4、5個(gè)堿基的位點(diǎn)，且保證僅有一種重復(fù)類型。通過與 Primer 3.0結(jié)合，對SSR引物實(shí)行批量設(shè)計(jì)，遵循基因所在的位置需分散、優(yōu)先選取已有多態(tài)的位點(diǎn)、不同組合的重復(fù)單元需均衡選擇等原則，初步篩選出適合擴(kuò)增的位點(diǎn)不重復(fù)的200對引物。合成過程中，所有正向引物F的5’端加上通用Tag的16個(gè)堿基的引物序列，第一次擴(kuò)增DNA時(shí)片段就多帶一段Tag序列。第二輪篩選擴(kuò)增條帶理想的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光引物PCR，引物采用Tag修飾引物和各自對應(yīng)的反向R引物。用Tag的修飾引物、帶Tag序列的F引物和R引物共3條引物可以一起多重?cái)U(kuò)增達(dá)到目的。將最終擴(kuò)增理想的熒光PCR產(chǎn)物在3730xl測序儀上進(jìn)行檢測，得到數(shù)據(jù)后用Genemapper軟件進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果，判斷不同引物是否具有片段多態(tài)性。

1.2.3 SSR-PCR篩選擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測。

選取差異性較大的8個(gè)樣品DNA用合成的200對引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中含10 μL的2×Master Mix（blue）（北京擎科生物科技有限公司）、1 μL的10 μmol/L Primer F（加接頭）、1 μL的10 μmol/L Primer R、1 μL的DNA樣品，不足的用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃冰箱冷藏保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測（3730xl型儀器，美國ABI公司）。用Gene mapper 4.1軟件計(jì)算SSR引物的多態(tài)性信息含量及位點(diǎn)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以條帶大小（bp）的方式統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體的特異性條帶，根據(jù)Gene mapper 4.1分析的峰圖建立原始數(shù)據(jù)矩陣。使用Popgen 32和GenAlEx version 6.501軟件，分別計(jì)算SSR位點(diǎn)和群體的各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo)；使用SSRUCTURE version 2.3.3 軟件，基于Evanno等［12］的方法，計(jì)算最適K值；在populations-1_2_30軟件中構(gòu)建UPGMA樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性

從200對引物中篩選出6對能穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶、無雜峰且通用性較高的引物（表2），用17個(gè)雪膽種質(zhì)樣品所提取的DNA對其進(jìn)行多態(tài)性評價(jià)。

從表3可以看出，6對引物在17份樣品中共檢測出38個(gè)等位基因位點(diǎn)（Na），其中，最小等位基因數(shù)目為5個(gè)，最大等位基因數(shù)目為8個(gè)，平均值為6.333 3個(gè)；有效等位基因（Ne）總數(shù)為22.564 9個(gè)，最小有效等位基因數(shù)目為2.480 7個(gè)，最大有效等位基因數(shù)目為4.982 8個(gè)，平均值為3.760 8個(gè)；觀測雜合度（Ho）為0.117 6～1.000 0，平均值為0.598 0；期望雜合度（He）為0.615 0～0.823 5，平均值為0.735 9。Shannon’s指數(shù)（I）為1.151 2～1.753 8，平均值為1.481 2；多態(tài)信息含量（PIC）為0.549 5～0.770 2，平均值為0.672 9，6對引物均具有較高的多態(tài)信息（PIC>0.5），兩者參數(shù)值變化趨于一致。分析表明篩選出的6對EST-SSR引物在17份樣品中的多態(tài)性較高，同時(shí)表明該研究收集的17份雪膽材料蘊(yùn)含了較為豐富的遺傳多樣性。

2.2 基于雪膽屬EST-SSR的群體結(jié)構(gòu)分析

在Structure Harvester中根據(jù)Evanno等［12］的方法進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，計(jì)算各K值對應(yīng)的均值（圖1），當(dāng)K=3時(shí)，出現(xiàn)最大拐點(diǎn)，即群體遺傳結(jié)構(gòu)的理論群體數(shù)為3。如圖2所示，不同顏色所占比重越大，則該種質(zhì)劃分到相應(yīng)組群的可能性就越大，第I亞群（紅色）來自織金、安順、納雍、黔南，均為肉花雪膽這一種的不同居群；第Ⅲ亞群（綠色）來自織金、凱里、納雍、威寧、水城，含肉花雪膽和母豬雪膽2種的居群；而劃分到第Ⅱ亞群（黃色）的種質(zhì)可能性均較低，說明產(chǎn)區(qū)內(nèi)雪膽種質(zhì)資源存在群體結(jié)構(gòu)較單一、遺傳背景過于狹窄等問題。由此可見，17份樣品可分為2個(gè)亞群。此外，織金、納雍等主產(chǎn)區(qū)的多數(shù)樣品分布于不同的亞群中，說明貴州省內(nèi)分布的雪膽屬植物群體結(jié)構(gòu)已趨向多樣化，同時(shí)與地理分布并不完全相關(guān)。

2.3 基于雪膽屬EST-SSR的聚類分析

在遺傳相似系數(shù)分析的基礎(chǔ)上，對17份樣品進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建出親緣關(guān)系樹狀圖。從圖3可以看出，17個(gè)樣品可劃分為4個(gè)組群，其中2份母豬雪膽（He16、He17）全部聚在第I組群；15份肉花雪膽分別聚在3個(gè)組群內(nèi)，第Ⅱ組僅為凱里的1個(gè)居群（He8），第Ⅲ組來自納雍、織金、威寧、水城和福泉（He4、He7、He11、He12、He13、He14、He15），第IV組來自織金、安順和納雍（He1、He2、He3、He5、He6、He9、He10），3個(gè)組群表現(xiàn)出較多的交叉混合，且存在于組間和群體間的個(gè)體中，體現(xiàn)了肉花雪膽群體內(nèi)存在較多的遺傳變異。來自納雍、織金和安順的種質(zhì)親緣關(guān)系較近，說明這些種質(zhì)資源起源相似或相互有更多的基因交流［13］；來自黔東南州凱里的居群（He8）與其他居群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相互之間缺乏基因交流。

3 小結(jié)與討論

由群體結(jié)構(gòu)與聚類分析結(jié)果可見，肉花雪膽和母豬雪膽存在明顯的種間遺傳分化。不同居群的肉花雪膽遺傳結(jié)構(gòu)并不嚴(yán)格按照分布地區(qū)劃分，這表明不同居群的肉花雪膽存在較高程度的基因交流，其中，來自納雍、織金和安順的種質(zhì)親緣關(guān)系較近，從地理位置上看，納雍和織金分布區(qū)處于相鄰位置，而安順與織金分布區(qū)距離較近，安順居群為藥農(nóng)從野外采挖后栽培，據(jù)調(diào)查，該居群源于織金地區(qū)，且織金地區(qū)肉花雪膽種質(zhì)資源數(shù)量較多，因此，這3個(gè)區(qū)域的肉花雪膽居群親緣關(guān)系較近，存在基因交流；來自黔東南州凱里的居群與其他居群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是由于該居群所在地處于貴州省東南，與其他居群完全隔離，因此群體之間基本沒有基因交流，導(dǎo)致凱里居群的遺傳基礎(chǔ)極為狹窄。從聚類結(jié)果還可以看出，有的種質(zhì)雖然來源于同一地區(qū)，但并未聚在一起，而有的種質(zhì)地理距離相隔較遠(yuǎn)卻聚在同一類中，顯示雪膽種質(zhì)之間的親緣關(guān)系較為復(fù)雜。

長久以來，雪膽屬下分類存在很多分歧［14］，Li等［15］基于ITS、rpl16、trnH-psbA、trnL 等分子序列對本屬 23 種植物進(jìn)行了分子系統(tǒng)的研究，但也無法解決屬內(nèi)的所有系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。該研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)開發(fā)出EST-SSR引物，并利用篩選出的SSR引物分析雪膽屬下種間和不同居群間的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，所開發(fā)的6對SSR引物多態(tài)性高，能將17份雪膽種質(zhì)材料區(qū)分開來，不同地區(qū)的肉花雪膽和母豬雪膽均具有較豐富的遺傳多樣性。該研究為雪膽屬植物的遺傳多樣性研究及后期分子標(biāo)記輔助育種奠定了重要基礎(chǔ)。

介于雪膽屬種質(zhì)間親緣關(guān)系較復(fù)雜、遺傳多樣性較豐富，在對該屬植物進(jìn)行引種栽培時(shí)需注重種質(zhì)的地理來源，保證其生態(tài)型的多元化，盡可能收集來源于多個(gè)地區(qū)的不同的居群或植株。同時(shí)，在選育過程中，應(yīng)最大限度地覆蓋雪膽屬植物種質(zhì)的基因庫，進(jìn)而保存更為豐富的遺傳多樣性，為下一步優(yōu)良品種的選育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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