譚倩 趙明鏡 魏執(zhí)真 蘇敬澤

心力衰竭是由多種原因?qū)е滦呐K收縮和(或)舒張功能障礙,心肌結(jié)構(gòu)和功能受損而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征。射血分?jǐn)?shù)保留心衰(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)是心衰的主要類型之一,近年來(lái)有不斷增加的趨勢(shì),臨床上有效干預(yù)相對(duì)缺乏,是治療的挑戰(zhàn)[1-2]。HFpEF的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,既有血流動(dòng)力學(xué)異常、代謝障礙,也涉及多種分子機(jī)制,其中心肌纖維化是HFpEF的突出病理特征[1-2],是引起心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的主要病理機(jī)制[3]。當(dāng)各種原因?qū)е滦募〖?xì)胞受到損傷時(shí),或壞死的心肌被纖維結(jié)締組織所取代,或心肌細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡,大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積于心肌間質(zhì),導(dǎo)致心肌纖維化,心肌順應(yīng)性下降,室壁僵硬度增加,舒張功能受損,是HFpEF形成的主要原因。另外,心肌纖維化在促進(jìn)和維持心律失常的發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用,是猝死的潛在危險(xiǎn)因素。由此可見心肌纖維化治療是心血管領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)課題之一。而對(duì)于心肌纖維化的治療中醫(yī)具有一定的優(yōu)勢(shì),因此中醫(yī)藥有望在治療HFpEF方面有所作為。

調(diào)脈飲(即糖心寧)是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)魏執(zhí)真教授從長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方劑,具有益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱的作用。既往實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:調(diào)脈飲具有改善高血壓和(或)糖尿病心衰患者舒張功能的作用,但是機(jī)制不明。本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的大鼠慢性心力衰竭模型,模擬HFpEF,探討調(diào)脈飲對(duì)HFpEF大鼠心肌纖維化的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～230 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障級(jí)動(dòng)物房,濕度(60±10)%,溫度(25±1)℃,晝夜交替。每天均提供標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

馬來(lái)酸依那普利片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司,10 mg/片,批號(hào):F13750)。調(diào)脈飲組成:太子參30 g、麥冬15 g、醋五味子10 g、醋香附10 g、香櫞10 g、佛手10 g、烏藥10 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、丹參30 g、川芎15 g。由北京市宣武中醫(yī)醫(yī)院煎藥室提供。

1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑

改良Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):G1345);血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所,貨號(hào):ml059369);膠原Ⅲ兔多克隆抗體(abcam,貨號(hào):zb7778)、二抗試劑盒(北京中杉金橋科技有限公司,貨號(hào):SP-9001、SPN-9001);α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(abcam,貨號(hào):ab32575);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor,TGF-β)抗體(abcam,貨號(hào):ab92486);纖連蛋白(fibronectin,FN)抗體(abcam,貨號(hào):ab2413);Smad7蛋白(Proteintech,貨號(hào):25840-1-AP);血管緊張素Ⅱ受體1(angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor,AGTR1)(Proteintech,貨號(hào):25343-1-AP)。其它試劑:4%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):P1110);乙醇溶液、二甲苯溶液、石蠟、PBS緩沖液(北京中杉金橋科技有限公司,貨號(hào):ZLI-9061);中性樹膠(北京中杉金橋科技有限公司,貨號(hào):ZLI-9555)、過(guò)氧化氫溶液(北京中杉金橋科技有限公司,貨號(hào):ZLI-9311D)。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器

超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司,21 MHz高頻線性陣列探頭);美國(guó)BIOPAC生理儀MP150;德國(guó)徠卡LEICA RM2245、LEICA RM2135切片機(jī),EICA HI1210烤片機(jī);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo MK3);電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組 大鼠共分為4組,結(jié)扎腹主動(dòng)脈動(dòng)物隨機(jī)分為3組(模型組、調(diào)脈飲組、西藥組),另有假手術(shù)組作為對(duì)照,每組8只大鼠。

1.5.2 造模方法 采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作大鼠模型,大鼠采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定,腹正中劍突下1 cm處切口,分層打開腹腔,在腎動(dòng)脈分支以上鈍性游離腹主動(dòng)脈,找到腹主動(dòng)脈的腎動(dòng)脈分支,在分支上方約0.5 cm處鈍性分離腹主動(dòng)脈約1 cm,將7號(hào)注射器針頭(磨平尖端)平行置于腹主動(dòng)脈上,用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和7號(hào)針頭一同結(jié)扎,然后緩慢將針頭撤出,縮窄大鼠腹主動(dòng)脈。關(guān)腹,逐層縫合。另取同源SD大鼠作為假手術(shù)組,只分離不結(jié)扎,術(shù)后腹腔注射青霉素40萬(wàn)單位/只,抗感染3天。

1.5.3 給藥方法 調(diào)脈飲組和西藥組分別給予調(diào)脈飲中藥[給藥劑量22.26 g/(kg·d)]和馬來(lái)酸依那普利[給藥劑量1.29 mg/(kg·d)]干預(yù),使用劑量按照臨床的6倍劑量。假手術(shù)組與模型組分別給予等體積的飲用水灌胃。動(dòng)物術(shù)后24小時(shí)開始灌胃給藥,干預(yù)12周。

1.5.4 取材方法 12周之后,使用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)處死大鼠,分別取血樣和心臟標(biāo)本,檢測(cè)血中AngⅡ含量,心肌組織用于Masson染色、免疫組化、蛋白免疫印跡等檢測(cè)。

1.6檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 血流動(dòng)力學(xué) 取材前,大鼠采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管送至左心室,BIOPAC生理記錄儀記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):(1)左心室收縮指標(biāo):左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室平均壓(left ventricular average pressure,LVAP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室開始收縮至最大變化速率(dp/dtmax)間隔時(shí)間(t-dp/dtmax);(2)左心室舒張指標(biāo):左心室舒張壓(left ventricular diastolic pressure,LVDP)、左心室終末舒張壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)、左心室壓力下降時(shí)間常數(shù)(T)。

1.6.2 Masson染色 (1)脫蠟、水化過(guò)程同HE染色;(2)按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行:蘇木素染5分鐘,自來(lái)水沖洗,1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒,流水沖洗數(shù)分鐘返藍(lán);麗春紅酸性品紅染液染5分鐘,蒸餾水快速漂洗;磷鉬酸水溶液處理3分鐘;苯胺藍(lán)復(fù)染5分鐘;1%冰醋酸分化1分鐘;(3)脫水、透明及封片同HE染色;(4)Masson分析方法:在顯微鏡下觀察,400倍拍照,每組選取8只大鼠,每只大鼠切片隨機(jī)選取5個(gè)視野。使用Image-Pro 圖象軟件進(jìn)行分析。光鏡下膠原纖維呈藍(lán)色,細(xì)胞核呈黑藍(lán)色,肌纖維為紅色。計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF),CVF%=心肌膠原面積/心肌細(xì)胞總面積×100%。

1.6.3 免疫組化檢測(cè)心?、笮湍z原 (1)脫蠟和水化步驟同HE染色;(2)酸性檸檬酸鹽溶液微波抗原修復(fù);3%H2O2水溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;滴加Ⅲ型膠原一抗(1∶200),4℃過(guò)夜;滴加反應(yīng)增強(qiáng)劑和Ⅱ抗室溫反應(yīng);DAB顯色;(3)脫水、透明、封片同HE染色;(4)Ⅲ型膠原分析方法:在顯微鏡下觀察,400倍拍照,每組選取8只大鼠,每只大鼠切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(心肌外層1個(gè),中層3個(gè),內(nèi)層1個(gè));應(yīng)用Image-Pro圖象軟件分別計(jì)算Ⅲ型膠原的膠原面積、平均光密度。心?、笮湍z原在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間隙著色,呈棕色顆粒。

1.6.4 放射免疫法檢測(cè)血及心臟中AngⅡ含量 采集動(dòng)物腹主動(dòng)脈全血,每組8只,低溫離心后收集血清;心臟組織勻漿,低溫離心收集組織上清,用放射免疫法測(cè)定血及心臟中AngⅡ含量。

1.6.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)心肌組織AGTR1、Smad7、TGF-β、α-SMA、FN含量 提取心臟組織蛋白,每組隨機(jī)選取3只測(cè)定蛋白濃度。將提取樣品緩慢加入凝膠上樣孔中,使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,設(shè)定電壓200 V電轉(zhuǎn)2小時(shí),5%脫脂奶粉封閉1小時(shí),孵育一抗,4℃過(guò)夜。TBST洗膜,孵育二抗1小時(shí),洗膜,發(fā)光。使用Image J軟件分析灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1大鼠一般狀態(tài)

假手術(shù)組大鼠安靜,體毛光澤,呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠毛發(fā)無(wú)光澤、不順滑,經(jīng)常出現(xiàn)躁動(dòng)不安,在實(shí)驗(yàn)后期,抓握時(shí)呼吸明顯比假手術(shù)組急促。與模型組相比,調(diào)脈飲組和西藥組大鼠毛發(fā)色澤較有光澤,抓握時(shí)呼吸急促改善。取材時(shí)打開胸腔和腹腔,各組均未見明顯胸水和腹水。

2.2調(diào)脈飲對(duì)左心室收縮功能的影響

與假手術(shù)組比較,結(jié)扎腹主動(dòng)脈12周的模型組大鼠的LVSP和左心室開始收縮至dp/dtmax間隔時(shí)間(t-dp/dtmax)均無(wú)明顯變化,然而其LVAP顯著上升(P<0.01),+dp/dtmax明顯減少(P<0.05)。調(diào)脈飲組和西藥組對(duì)左心室收縮功能無(wú)明顯影響。見表1。

表1 調(diào)脈飲對(duì)HFpEF模型大鼠左心室收縮功能的影響

2.3調(diào)脈飲對(duì)左心室舒張功能的影響

結(jié)扎腹主動(dòng)脈12周的模型組大鼠的LVDP、LVEDP、-dp/dtmax和左心室壓力下降時(shí)間常數(shù)(T)均明顯升高;與假手術(shù)組比較,四項(xiàng)指標(biāo)的差異均顯著(P<0.05,P<0.01)。調(diào)脈飲組和西藥組對(duì)LVDP、LVEDP和-dp/dtmax的均值都有降低,但由于標(biāo)準(zhǔn)差大,沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 調(diào)脈飲對(duì)HFpEF模型大鼠左心室舒張功能的影響

2.4調(diào)脈飲對(duì)心肌總膠原和Ⅲ型膠原的影響

模型組大鼠心肌CVF明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組相比,調(diào)脈飲組和西藥組心肌CVF均明顯降低(P<0.01)。見表3、圖1。

注:A 假手術(shù)組;B 模型組;C 西藥組;D 調(diào)脈飲組。

表3 調(diào)脈飲對(duì)HFpEF模型大鼠心肌總膠原的影響

與假手術(shù)組比,模型組心臟的平均光密度均值增加但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比,調(diào)脈飲組和西藥組的平均光密度顯著降低(P<0.05)。模型組的心?、笮湍z原累積光密度總值較假手術(shù)組偏高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,西藥組心?、笮湍z原累積光密度總值減少(P<0.05);調(diào)脈飲組也可減少心肌Ⅲ型膠原累積光密度總值,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 調(diào)脈飲對(duì)HFpEF模型大鼠心?、笮湍z原平均光密度和累積光密度的影響

2.5調(diào)脈飲對(duì)心肌組織及血清中AngⅡ的影響

模型組心肌組織及血清中的AngⅡ明顯增加,較假手術(shù)組有顯著差異(P<0.05);與模型組相比,調(diào)脈飲組和西藥組均可以顯著降低血清中AngⅡ的含量(P<0.05)。見表5。

表5 調(diào)脈飲對(duì)HFpEF模型大鼠心肌組織及血清中AngⅡ的影響

2.6調(diào)脈飲對(duì)心肌纖維化相關(guān)蛋白的影響

模型組心肌組織中Smad7蛋白較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05);與模型組比較,西藥組和調(diào)脈飲組明Smad7蛋白顯升高(P<0.05);與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織TGF-β明顯升高(P<0.05);西藥組和調(diào)脈飲組的TGF-β含量較模型組顯著降低(P<0.05)。模型組α-SMA的均值下降,西藥組和調(diào)脈飲組的α-SMA均值增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西藥組和調(diào)脈飲組對(duì)AGTR1和FN蛋白均沒有顯著的影響。見表6、圖2～6。

注:A 假手術(shù)組;B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術(shù)組; B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術(shù)組; B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術(shù)組; B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術(shù)組;B 模型組;C 西藥組;D 調(diào)脈飲組。

表6 調(diào)脈飲對(duì)HFpEF模型大鼠心肌纖維化相關(guān)蛋白的影響

3 討論

HFpEF是一種舒張性心力衰竭,其與射血分?jǐn)?shù)降低心衰患者相比發(fā)病率高、預(yù)后較差。根據(jù)歐洲心臟病學(xué)會(huì)指南(2016)[4],HFpEF迄今為止尚未被證明有令人信服的治療方法來(lái)降低其發(fā)病率和死亡率。心肌纖維化是HFpEF的核心病理機(jī)制和突出特征[4]，而腎素—血管緊張素系統(tǒng)的激活促進(jìn)心肌纖維化,同時(shí)TGF-β1/Smad通路是纖維化的主要信號(hào)通路,因此抑制腎素—血管緊張素系統(tǒng)和調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路,抑制纖維化是改善HFpEF的重要途徑。由于高血壓、糖尿病等是引起HFpEF的主要原發(fā)性疾病,本研究采用大鼠腹主動(dòng)脈結(jié)扎致慢性心力衰竭模型,其原理是腹主動(dòng)脈結(jié)扎造成心臟的前負(fù)荷(壓力)增加,同時(shí)腎臟缺血導(dǎo)致造成腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)的激活,造成心肌代償性重構(gòu)、心肌纖維化、心室壁僵硬進(jìn)而引起舒張功能減弱。

以往的研究表明,調(diào)脈飲是長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出來(lái)的治療快速性心律失常的有效方劑,其在動(dòng)物模型和心肌細(xì)胞的作用已經(jīng)得到充分的驗(yàn)證。但是關(guān)于調(diào)脈飲對(duì)心臟舒張功能和心肌纖維化的影響尚未見報(bào)道[5-7]。本研究通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄致心衰大鼠模型,首次探討了調(diào)脈飲對(duì)于HFpEF大鼠的治療效果及潛在的機(jī)制。

在本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的心臟舒張性指標(biāo)LVDP、LVEDP、-dp/dtmax和左心室壓力下降時(shí)間常數(shù)(T)均明顯升高,這表明心臟左心室舒張終末壓增高,舒張期主動(dòng)松弛充盈能力受損和心肌順應(yīng)性降低,模型組大鼠出現(xiàn)明顯的舒張功能障礙,造模成功。同時(shí)模型組大鼠LVSP和t-dp/dtmax無(wú)明顯變化,而dp/dtmax顯著降低,這與HFpEF也存在一定程度的收縮功能受損的報(bào)道相一致[8]。調(diào)脈飲和依那普利對(duì)心臟舒張功能相關(guān)指標(biāo)有降低作用,但由于標(biāo)準(zhǔn)差過(guò)大,并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此,調(diào)脈飲對(duì)高血壓引起的舒張功能的影響,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

心肌纖維化是導(dǎo)致HFpEF的核心病理改變。其他研究表明壓力負(fù)荷、腎素—血管緊張素系統(tǒng)和纖維生長(zhǎng)因子等的刺激會(huì)使心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞,合成并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì),并沉積于心肌細(xì)胞間,形成心肌纖維化,促使心肌僵硬[4]。心臟中的細(xì)胞外基質(zhì)主要以I型和Ⅲ型膠原為主,I型膠原粗大,Ⅲ型膠原為細(xì)纖維,后者約占心肌細(xì)胞外膠原網(wǎng)15%,在心肌的延展和回彈特性中發(fā)揮重要作用[9]。心肌CVF是反映心肌纖維化程度的重要指標(biāo),本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠心肌CVF明顯增加,調(diào)脈飲能夠顯著降低心衰大鼠CVF值,同時(shí)顯著降低心?、笮湍z原平均光密度,但對(duì)積分光密度沒有影響。由此可見,調(diào)脈飲可降低心肌總膠原含量,抑制心肌間質(zhì)纖維化,從而增強(qiáng)心壁順應(yīng)性。

在受損或重塑時(shí),心肌會(huì)產(chǎn)生AngⅡ,而AngⅡ?qū)π呐K有強(qiáng)大的致纖維化作用,成纖維細(xì)胞通過(guò)與AGTR1受體的相互作用,促進(jìn)成纖維細(xì)胞肌轉(zhuǎn)化,并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)[4]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠心肌組織和血清中AngⅡ均顯著增加,調(diào)脈飲明顯降低血清中AngⅡ的含量,對(duì)心肌組織中AngⅡ的數(shù)值有降低的趨勢(shì),但對(duì)AGTR1的蛋白表達(dá)沒有影響,這可能與AGTR1不僅與AngⅡ相關(guān),同時(shí)還受血壓等因素調(diào)節(jié)有關(guān)[4]。

TGF-β是組織纖維化的主要刺激因子,它與成纖維細(xì)胞向成肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及纖維化典型的Smad信號(hào)通路的激活有關(guān)。研究表明[10-11],TGF-β的大多數(shù)促纖維化活性是由Smad3介導(dǎo)的,而Smad7是一種抑制性Smad蛋白,能夠與Smad3和TGF-β受體復(fù)合物結(jié)合競(jìng)爭(zhēng),從而阻止隨后的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,抑制纖維化。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠TGF-β明顯增高,Smad7明顯降低,調(diào)脈飲組心臟TGF-β表達(dá)顯著下降,Smad7表達(dá)顯著上調(diào),表明調(diào)脈飲通過(guò)上調(diào)Smad7的蛋白表達(dá)來(lái)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路,并進(jìn)一步抑制纖維化的病理進(jìn)程,該作用與西藥相當(dāng)。此外,調(diào)脈飲可顯著降低心衰大鼠血液中循環(huán)AngⅡ水平,也可以阻礙下游TGF-β1的誘導(dǎo)和激活。

綜上所述,本研究通過(guò)縮窄大鼠腹主動(dòng)脈造成慢性心力衰竭模型,并依據(jù)益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱治法,使用調(diào)脈飲對(duì)模型進(jìn)行早期干預(yù)。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)脈飲有一定改善舒張功能的趨勢(shì),明顯改善心衰大鼠的心肌纖維化程度,其機(jī)制可能是由于其降低血中AngⅡ的含量,并且降低心肌組織TGF-β蛋白、升高Smad7蛋白表達(dá)含量有關(guān),從而發(fā)揮改善心臟舒張功能和心肌纖維化作用,為調(diào)脈飲的治療HFpEF的臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。