譚倩 趙明鏡 魏執(zhí)真 蘇敬澤

心力衰竭是由多種原因?qū)е滦呐K收縮和(或)舒張功能障礙,心肌結(jié)構(gòu)和功能受損而引起的一組復雜臨床綜合征。射血分數(shù)保留心衰(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)是心衰的主要類型之一,近年來有不斷增加的趨勢,臨床上有效干預相對缺乏,是治療的挑戰(zhàn)[1-2]。HFpEF的發(fā)生機制復雜,既有血流動力學異常、代謝障礙,也涉及多種分子機制,其中心肌纖維化是HFpEF的突出病理特征[1-2],是引起心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的主要病理機制[3]。當各種原因?qū)е滦募〖毎艿綋p傷時,或壞死的心肌被纖維結(jié)締組織所取代,或心肌細胞外基質(zhì)合成和降解失衡,大量的細胞外基質(zhì)沉積于心肌間質(zhì),導致心肌纖維化,心肌順應性下降,室壁僵硬度增加,舒張功能受損,是HFpEF形成的主要原因。另外,心肌纖維化在促進和維持心律失常的發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用,是猝死的潛在危險因素。由此可見心肌纖維化治療是心血管領域的重點和難點課題之一。而對于心肌纖維化的治療中醫(yī)具有一定的優(yōu)勢,因此中醫(yī)藥有望在治療HFpEF方面有所作為。

調(diào)脈飲(即糖心寧)是國家級名老中醫(yī)魏執(zhí)真教授從長期臨床實踐中總結(jié)出來的經(jīng)驗方劑,具有益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱的作用。既往實驗研究結(jié)果表明:調(diào)脈飲具有改善高血壓和(或)糖尿病心衰患者舒張功能的作用,但是機制不明。本研究采用腹主動脈縮窄誘導的大鼠慢性心力衰竭模型,模擬HFpEF,探討調(diào)脈飲對HFpEF大鼠心肌纖維化的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及實驗環(huán)境

雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～230 g,購于北京維通利華實驗動物中心,許可證號:SCXK(京)2016-0011。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院屏障級動物房,濕度(60±10)%,溫度(25±1)℃,晝夜交替。每天均提供標準飼料及飲用水。

1.2實驗藥物

馬來酸依那普利片(揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司,10 mg/片,批號:F13750)。調(diào)脈飲組成:太子參30 g、麥冬15 g、醋五味子10 g、醋香附10 g、香櫞10 g、佛手10 g、烏藥10 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、丹參30 g、川芎15 g。由北京市宣武中醫(yī)醫(yī)院煎藥室提供。

1.3主要實驗試劑

改良Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1345);血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)試劑盒(北京北方生物技術研究所,貨號:ml059369);膠原Ⅲ兔多克隆抗體(abcam,貨號:zb7778)、二抗試劑盒(北京中杉金橋科技有限公司,貨號:SP-9001、SPN-9001);α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(abcam,貨號:ab32575);轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)抗體(abcam,貨號:ab92486);纖連蛋白(fibronectin,FN)抗體(abcam,貨號:ab2413);Smad7蛋白(Proteintech,貨號:25840-1-AP);血管緊張素Ⅱ受體1(angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor,AGTR1)(Proteintech,貨號:25343-1-AP)。其它試劑:4%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P1110);乙醇溶液、二甲苯溶液、石蠟、PBS緩沖液(北京中杉金橋科技有限公司,貨號:ZLI-9061);中性樹膠(北京中杉金橋科技有限公司,貨號:ZLI-9555)、過氧化氫溶液(北京中杉金橋科技有限公司,貨號:ZLI-9311D)。

1.4主要實驗儀器

超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司,21 MHz高頻線性陣列探頭);美國BIOPAC生理儀MP150;德國徠卡LEICA RM2245、LEICA RM2135切片機,EICA HI1210烤片機;酶標儀(美國Thermo MK3);電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.5實驗方法

1.5.1 動物分組 大鼠共分為4組,結(jié)扎腹主動脈動物隨機分為3組(模型組、調(diào)脈飲組、西藥組),另有假手術組作為對照,每組8只大鼠。

1.5.2 造模方法 采用腹主動脈縮窄法制作大鼠模型,大鼠采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定,腹正中劍突下1 cm處切口,分層打開腹腔,在腎動脈分支以上鈍性游離腹主動脈,找到腹主動脈的腎動脈分支,在分支上方約0.5 cm處鈍性分離腹主動脈約1 cm,將7號注射器針頭(磨平尖端)平行置于腹主動脈上,用4號手術絲線將腹主動脈和7號針頭一同結(jié)扎,然后緩慢將針頭撤出,縮窄大鼠腹主動脈。關腹,逐層縫合。另取同源SD大鼠作為假手術組,只分離不結(jié)扎,術后腹腔注射青霉素40萬單位/只,抗感染3天。

1.5.3 給藥方法 調(diào)脈飲組和西藥組分別給予調(diào)脈飲中藥[給藥劑量22.26 g/(kg·d)]和馬來酸依那普利[給藥劑量1.29 mg/(kg·d)]干預,使用劑量按照臨床的6倍劑量。假手術組與模型組分別給予等體積的飲用水灌胃。動物術后24小時開始灌胃給藥,干預12周。

1.5.4 取材方法 12周之后,使用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)處死大鼠,分別取血樣和心臟標本,檢測血中AngⅡ含量,心肌組織用于Masson染色、免疫組化、蛋白免疫印跡等檢測。

1.6檢測指標

1.6.1 血流動力學 取材前,大鼠采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定。分離右側(cè)頸總動脈,經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管送至左心室,BIOPAC生理記錄儀記錄血流動力學指標:(1)左心室收縮指標:左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室平均壓(left ventricular average pressure,LVAP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室開始收縮至最大變化速率(dp/dtmax)間隔時間(t-dp/dtmax);(2)左心室舒張指標:左心室舒張壓(left ventricular diastolic pressure,LVDP)、左心室終末舒張壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)、左心室壓力下降時間常數(shù)(T)。

1.6.2 Masson染色 (1)脫蠟、水化過程同HE染色;(2)按試劑盒說明書步驟進行:蘇木素染5分鐘,自來水沖洗,1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒,流水沖洗數(shù)分鐘返藍;麗春紅酸性品紅染液染5分鐘,蒸餾水快速漂洗;磷鉬酸水溶液處理3分鐘;苯胺藍復染5分鐘;1%冰醋酸分化1分鐘;(3)脫水、透明及封片同HE染色;(4)Masson分析方法:在顯微鏡下觀察,400倍拍照,每組選取8只大鼠,每只大鼠切片隨機選取5個視野。使用Image-Pro 圖象軟件進行分析。光鏡下膠原纖維呈藍色,細胞核呈黑藍色,肌纖維為紅色。計算膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction,CVF),CVF%=心肌膠原面積/心肌細胞總面積×100%。

1.6.3 免疫組化檢測心肌Ⅲ型膠原 (1)脫蠟和水化步驟同HE染色;(2)酸性檸檬酸鹽溶液微波抗原修復;3%H2O2水溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶;滴加Ⅲ型膠原一抗(1∶200),4℃過夜;滴加反應增強劑和Ⅱ抗室溫反應;DAB顯色;(3)脫水、透明、封片同HE染色;(4)Ⅲ型膠原分析方法:在顯微鏡下觀察,400倍拍照,每組選取8只大鼠,每只大鼠切片隨機選取5個視野(心肌外層1個,中層3個,內(nèi)層1個);應用Image-Pro圖象軟件分別計算Ⅲ型膠原的膠原面積、平均光密度。心肌Ⅲ型膠原在細胞質(zhì)和細胞間隙著色,呈棕色顆粒。

1.6.4 放射免疫法檢測血及心臟中AngⅡ含量 采集動物腹主動脈全血,每組8只,低溫離心后收集血清;心臟組織勻漿,低溫離心收集組織上清,用放射免疫法測定血及心臟中AngⅡ含量。

1.6.5 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織AGTR1、Smad7、TGF-β、α-SMA、FN含量 提取心臟組織蛋白,每組隨機選取3只測定蛋白濃度。將提取樣品緩慢加入凝膠上樣孔中,使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,設定電壓200 V電轉(zhuǎn)2小時,5%脫脂奶粉封閉1小時,孵育一抗,4℃過夜。TBST洗膜,孵育二抗1小時,洗膜,發(fā)光。使用Image J軟件分析灰度值。

1.7統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1大鼠一般狀態(tài)

假手術組大鼠安靜,體毛光澤,呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠毛發(fā)無光澤、不順滑,經(jīng)常出現(xiàn)躁動不安,在實驗后期,抓握時呼吸明顯比假手術組急促。與模型組相比,調(diào)脈飲組和西藥組大鼠毛發(fā)色澤較有光澤,抓握時呼吸急促改善。取材時打開胸腔和腹腔,各組均未見明顯胸水和腹水。

2.2調(diào)脈飲對左心室收縮功能的影響

與假手術組比較,結(jié)扎腹主動脈12周的模型組大鼠的LVSP和左心室開始收縮至dp/dtmax間隔時間(t-dp/dtmax)均無明顯變化,然而其LVAP顯著上升(P<0.01),+dp/dtmax明顯減少(P<0.05)。調(diào)脈飲組和西藥組對左心室收縮功能無明顯影響。見表1。

表1 調(diào)脈飲對HFpEF模型大鼠左心室收縮功能的影響

2.3調(diào)脈飲對左心室舒張功能的影響

結(jié)扎腹主動脈12周的模型組大鼠的LVDP、LVEDP、-dp/dtmax和左心室壓力下降時間常數(shù)(T)均明顯升高;與假手術組比較,四項指標的差異均顯著(P<0.05,P<0.01)。調(diào)脈飲組和西藥組對LVDP、LVEDP和-dp/dtmax的均值都有降低,但由于標準差大,沒有明顯統(tǒng)計學差異。見表2。

表2 調(diào)脈飲對HFpEF模型大鼠左心室舒張功能的影響

2.4調(diào)脈飲對心肌總膠原和Ⅲ型膠原的影響

模型組大鼠心肌CVF明顯高于假手術組(P<0.01);與模型組相比,調(diào)脈飲組和西藥組心肌CVF均明顯降低(P<0.01)。見表3、圖1。

注:A 假手術組;B 模型組;C 西藥組;D 調(diào)脈飲組。

表3 調(diào)脈飲對HFpEF模型大鼠心肌總膠原的影響

與假手術組比,模型組心臟的平均光密度均值增加但差異無統(tǒng)計學意義。與模型組比,調(diào)脈飲組和西藥組的平均光密度顯著降低(P<0.05)。模型組的心肌Ⅲ型膠原累積光密度總值較假手術組偏高,但差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比,西藥組心?、笮湍z原累積光密度總值減少(P<0.05);調(diào)脈飲組也可減少心肌Ⅲ型膠原累積光密度總值,但差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 調(diào)脈飲對HFpEF模型大鼠心?、笮湍z原平均光密度和累積光密度的影響

2.5調(diào)脈飲對心肌組織及血清中AngⅡ的影響

模型組心肌組織及血清中的AngⅡ明顯增加,較假手術組有顯著差異(P<0.05);與模型組相比,調(diào)脈飲組和西藥組均可以顯著降低血清中AngⅡ的含量(P<0.05)。見表5。

表5 調(diào)脈飲對HFpEF模型大鼠心肌組織及血清中AngⅡ的影響

2.6調(diào)脈飲對心肌纖維化相關蛋白的影響

模型組心肌組織中Smad7蛋白較假手術組明顯降低(P<0.05);與模型組比較,西藥組和調(diào)脈飲組明Smad7蛋白顯升高(P<0.05);與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織TGF-β明顯升高(P<0.05);西藥組和調(diào)脈飲組的TGF-β含量較模型組顯著降低(P<0.05)。模型組α-SMA的均值下降,西藥組和調(diào)脈飲組的α-SMA均值增加,但差異無統(tǒng)計學意義。西藥組和調(diào)脈飲組對AGTR1和FN蛋白均沒有顯著的影響。見表6、圖2～6。

注:A 假手術組;B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術組; B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術組; B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術組; B 模型組; C 西藥組; D 調(diào)脈飲組。

注: A 假手術組;B 模型組;C 西藥組;D 調(diào)脈飲組。

表6 調(diào)脈飲對HFpEF模型大鼠心肌纖維化相關蛋白的影響

3 討論

HFpEF是一種舒張性心力衰竭,其與射血分數(shù)降低心衰患者相比發(fā)病率高、預后較差。根據(jù)歐洲心臟病學會指南(2016)[4],HFpEF迄今為止尚未被證明有令人信服的治療方法來降低其發(fā)病率和死亡率。心肌纖維化是HFpEF的核心病理機制和突出特征[4]，而腎素—血管緊張素系統(tǒng)的激活促進心肌纖維化,同時TGF-β1/Smad通路是纖維化的主要信號通路,因此抑制腎素—血管緊張素系統(tǒng)和調(diào)節(jié)相關信號通路,抑制纖維化是改善HFpEF的重要途徑。由于高血壓、糖尿病等是引起HFpEF的主要原發(fā)性疾病,本研究采用大鼠腹主動脈結(jié)扎致慢性心力衰竭模型,其原理是腹主動脈結(jié)扎造成心臟的前負荷(壓力)增加,同時腎臟缺血導致造成腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)的激活,造成心肌代償性重構(gòu)、心肌纖維化、心室壁僵硬進而引起舒張功能減弱。

以往的研究表明,調(diào)脈飲是長期臨床實踐中總結(jié)出來的治療快速性心律失常的有效方劑,其在動物模型和心肌細胞的作用已經(jīng)得到充分的驗證。但是關于調(diào)脈飲對心臟舒張功能和心肌纖維化的影響尚未見報道[5-7]。本研究通過腹主動脈縮窄致心衰大鼠模型,首次探討了調(diào)脈飲對于HFpEF大鼠的治療效果及潛在的機制。

在本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的心臟舒張性指標LVDP、LVEDP、-dp/dtmax和左心室壓力下降時間常數(shù)(T)均明顯升高,這表明心臟左心室舒張終末壓增高,舒張期主動松弛充盈能力受損和心肌順應性降低,模型組大鼠出現(xiàn)明顯的舒張功能障礙,造模成功。同時模型組大鼠LVSP和t-dp/dtmax無明顯變化,而dp/dtmax顯著降低,這與HFpEF也存在一定程度的收縮功能受損的報道相一致[8]。調(diào)脈飲和依那普利對心臟舒張功能相關指標有降低作用,但由于標準差過大,并無統(tǒng)計學差異。因此,調(diào)脈飲對高血壓引起的舒張功能的影響,還需要進一步驗證。

心肌纖維化是導致HFpEF的核心病理改變。其他研究表明壓力負荷、腎素—血管緊張素系統(tǒng)和纖維生長因子等的刺激會使心肌細胞和成纖維細胞活化為肌成纖維細胞,合成并分泌大量的細胞外基質(zhì),并沉積于心肌細胞間,形成心肌纖維化,促使心肌僵硬[4]。心臟中的細胞外基質(zhì)主要以I型和Ⅲ型膠原為主,I型膠原粗大,Ⅲ型膠原為細纖維,后者約占心肌細胞外膠原網(wǎng)15%,在心肌的延展和回彈特性中發(fā)揮重要作用[9]。心肌CVF是反映心肌纖維化程度的重要指標,本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠心肌CVF明顯增加,調(diào)脈飲能夠顯著降低心衰大鼠CVF值,同時顯著降低心?、笮湍z原平均光密度,但對積分光密度沒有影響。由此可見,調(diào)脈飲可降低心肌總膠原含量,抑制心肌間質(zhì)纖維化,從而增強心壁順應性。

在受損或重塑時,心肌會產(chǎn)生AngⅡ,而AngⅡ?qū)π呐K有強大的致纖維化作用,成纖維細胞通過與AGTR1受體的相互作用,促進成纖維細胞肌轉(zhuǎn)化,并產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)[4]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠心肌組織和血清中AngⅡ均顯著增加,調(diào)脈飲明顯降低血清中AngⅡ的含量,對心肌組織中AngⅡ的數(shù)值有降低的趨勢,但對AGTR1的蛋白表達沒有影響,這可能與AGTR1不僅與AngⅡ相關,同時還受血壓等因素調(diào)節(jié)有關[4]。

TGF-β是組織纖維化的主要刺激因子,它與成纖維細胞向成肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化以及纖維化典型的Smad信號通路的激活有關。研究表明[10-11],TGF-β的大多數(shù)促纖維化活性是由Smad3介導的,而Smad7是一種抑制性Smad蛋白,能夠與Smad3和TGF-β受體復合物結(jié)合競爭,從而阻止隨后的信號傳導過程,抑制纖維化。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠TGF-β明顯增高,Smad7明顯降低,調(diào)脈飲組心臟TGF-β表達顯著下降,Smad7表達顯著上調(diào),表明調(diào)脈飲通過上調(diào)Smad7的蛋白表達來抑制TGF-β1/Smad3信號通路,并進一步抑制纖維化的病理進程,該作用與西藥相當。此外,調(diào)脈飲可顯著降低心衰大鼠血液中循環(huán)AngⅡ水平,也可以阻礙下游TGF-β1的誘導和激活。

綜上所述,本研究通過縮窄大鼠腹主動脈造成慢性心力衰竭模型,并依據(jù)益氣養(yǎng)心、理氣通脈、涼血清熱治法,使用調(diào)脈飲對模型進行早期干預。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)脈飲有一定改善舒張功能的趨勢,明顯改善心衰大鼠的心肌纖維化程度,其機制可能是由于其降低血中AngⅡ的含量,并且降低心肌組織TGF-β蛋白、升高Smad7蛋白表達含量有關,從而發(fā)揮改善心臟舒張功能和心肌纖維化作用,為調(diào)脈飲的治療HFpEF的臨床應用提供了重要依據(jù)。