向 蒙，熊詩(shī)俊，彭逸斯，黃莉萍，何 鮮，張瑤婷，彭國(guó)平**

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.道地藥用植物規(guī)范化栽培綜合利用湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.靖州康源苓業(yè)科技股份有限公司，湖南 懷化 418400；4.懷化市中藥材規(guī)范化栽培與產(chǎn)地?zé)o硫干燥工程技術(shù)研究中心，湖南 懷化 418400）

茯苓[Wolfiporia cocos（shw.）Rvy.&Gilbn]為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）茯苓屬（WolfiporiaRvy.&Gilbn）腐生菌，多寄生于馬尾松（Pinus massonianaLamb）和赤松（Pinus densifloraSiebold &Zucc）的根部，是我國(guó)重要的“藥食同源”中藥材之一[1]。茯苓菌絲扭結(jié)在一起硬化后形成菌核，即為茯苓藥材加工的原料[2]。人工栽培需要先收集野生茯苓菌種，再通過(guò)良種篩選和繁育獲得優(yōu)良栽培品種，難度大、周期長(zhǎng)、費(fèi)用高。而菌種經(jīng)多代無(wú)性繁殖會(huì)導(dǎo)致退化，加上雜菌污染會(huì)使菌種更加不純，在生產(chǎn)上常出現(xiàn)低產(chǎn)、空窖、爛窖的現(xiàn)象，嚴(yán)重降低了茯苓的生產(chǎn)效率。優(yōu)良菌種培養(yǎng)和退化菌種復(fù)壯是使茯苓增產(chǎn)、增效最有效的措施之一。

通過(guò)對(duì)茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)基和復(fù)壯培養(yǎng)基中的碳源、氮源、初始pH 以及培養(yǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，篩選出茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)與復(fù)壯培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，以期為茯苓的人工栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試茯苓菌核由靖州康源苓業(yè)科技股份有限公司于2021年3月提供。

1.1.2 主要試劑

酵母膏、蛋白胨、玉米蛋白粉、瓊脂粉均為生化試劑，上海盛思生化科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、（NH4）2SO4、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HCl、NaOH 均為分析純，株洲市星空化玻有限責(zé)任公司。

1.1.3 主要儀器

FA-2014N 型電子天平，上海菁海儀器有限公司；SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái)，蘇州設(shè)備凈化有限公司；LBI-250 型恒溫培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；DHG-9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，中儀國(guó)科科技有限公司；GI54DWS 型高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茯苓菌絲分離純化

將供試茯苓菌核從中間部位切開，在切面中心部位切取數(shù)塊大小基本一致的菌塊，將菌塊接種到固體培養(yǎng)基中央，在25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。將純化后的菌絲進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 茯苓待復(fù)壯菌絲準(zhǔn)備

將連續(xù)培養(yǎng)20 代以上，已出現(xiàn)退化現(xiàn)象的茯苓菌絲活化培養(yǎng)96 h 后，采用尖端菌絲分離法[3]，用牛津杯打孔取長(zhǎng)勢(shì)好的尖端外緣3 mm 處的菌絲，將其轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，重復(fù)操作2 次。

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

試驗(yàn)均在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中進(jìn)行，待菌種培養(yǎng)至48 h 時(shí)在菌落外緣處畫初始線，培養(yǎng)至96 h時(shí)在菌落外緣處畫終止線。測(cè)量初始線和終止線間的距離，生長(zhǎng)速度（C，cm·d-1）的計(jì)算公式為：

C=D/2

式中：D為初始線與終止線間的距離（cm）。

1.2.4 培養(yǎng)條件篩選單因素試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（G）的配方為：酵母膏0.5 g、MgSO4·7H2O 0.125 g、KH2PO40.25 g、K2HPO40.115 g、瓊脂5 g，加水250 mL[4]。

1）碳源篩選試驗(yàn)：在G 中加入（NH4）2SO40.5 g為氮源，再分別加入5 g 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉，得到配方C1、C2、C3、C4，將pH 調(diào)至6.0。接種后將培養(yǎng)皿置于25 ℃條件下培養(yǎng)。

2）氮源篩選試驗(yàn)：在G 中加入葡萄糖5 g 為碳源，再分別加入0.5 g 蛋白胨、玉米蛋白粉、（NH4）2SO4和NH4NO3，得到配方N1、N2、N3、N4，將pH 調(diào)至6.0。接種后將培養(yǎng)皿置于25 ℃條件下培養(yǎng)。

3）培養(yǎng)溫度篩選試驗(yàn)：在G 中加入葡萄糖5 g、（NH4）2SO40.5 g，將pH 調(diào)至6.0。接種后分別將培養(yǎng)皿置于22、25、28、31、34 ℃條件下培養(yǎng)，編號(hào)分別為T1、T2、T3、T4、T5。

4）初始pH 篩選試驗(yàn)：在G 中加入葡萄糖5 g、（NH4）2SO40.5 g 后，將pH 分別調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，得到配方P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11。接種后將培養(yǎng)皿置于25 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.5 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)基中的碳源、氮源、初始pH、培養(yǎng)溫度為變量因素（各設(shè)3 個(gè)水平），以生長(zhǎng)速度及菌落形態(tài)特征為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)條件。菌絲常規(guī)培養(yǎng)及菌絲復(fù)壯培養(yǎng)正交試驗(yàn)因素水平見表1 和表2。

表1 菌絲常規(guī)培養(yǎng)正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Levels and factors of orthogonal design for mycelial routine culture

表2 菌絲復(fù)壯培養(yǎng)正交設(shè)計(jì)因素水平Tab.2 Levels and factors of orthogonal design for mycelial rejuvenation culture

1.2.6 茯苓菌絲復(fù)壯前后對(duì)比試驗(yàn)

分別將完成復(fù)壯培養(yǎng)的菌絲和退化菌絲接種于固體培養(yǎng)基中央，于25 ℃條件下培養(yǎng)96 h 后，觀察菌落形態(tài)、菌絲的顯微特征，并測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2020 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析、聚類分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)及復(fù)壯培養(yǎng)的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果

碳源對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度及菌落形態(tài)的影響情況見表3、圖1 和圖2。

圖1 碳源對(duì)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.1 Effect of carbon source on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖2 碳源對(duì)茯苓菌落形態(tài)的影響Fig.2 Effect of carbon source on colony morphological of Wolfiporia cocos

表3 碳源對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.3 Effect of carbon sources on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表3、圖1 和圖2世紀(jì)，以葡萄糖（C1）作為碳源時(shí)，菌絲常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)中的茯苓菌絲生長(zhǎng)速度均最快，菌絲潔白、綿密，菌苔較厚，復(fù)壯效果最好。

2.1.2 氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果

氮源對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度及菌落形態(tài)的影響情況見表4、圖3 和圖4。

圖3 氮源對(duì)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖4 氮源對(duì)茯苓菌落形態(tài)的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on colony morphological of Wolfiporia cocos

表4 氮源對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.4 Effects of nitrogen sources on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表4、圖3 和圖4世紀(jì)，（NH4）2SO4（N3）與酵母膏聯(lián)合作為氮源時(shí)，菌絲常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)中的茯苓菌絲生長(zhǎng)速度均最快，菌絲潔白、綿密，菌苔較厚，復(fù)壯效果最好。

2.1.3 培養(yǎng)溫度篩選試驗(yàn)結(jié)果

溫度對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度及菌落形態(tài)的影響情況見表5、圖5 和圖6。

圖5 溫度對(duì)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.5 Effect of temperature on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖6 溫度對(duì)茯苓菌落形態(tài)的影響Fig.6 Effect of temperature on colony morphological of Wolfiporia cocos

表5 溫度對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.5 Effect of temperature on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表5、圖5 和圖6世紀(jì)，從22～34 ℃溫度越高菌絲生長(zhǎng)速度越快，28～34℃下菌苔較厚。茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)中25 ℃條件下菌絲生長(zhǎng)速度最快，但菌苔稀??；28～34 ℃下茯苓菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌絲綿密、色白，菌苔厚，生長(zhǎng)旺盛。因此，28～34 ℃適宜進(jìn)行茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)。

2.1.4 pH 篩選試驗(yàn)結(jié)果

pH 對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度及菌落形態(tài)的影響情況見表6、圖7 和圖8。

圖7 pH 對(duì)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.7 Effect of pH on mycelial growth rate of Wolfiporia cocos

圖8 pH 對(duì)茯苓菌落形態(tài)的影響Fig.8 Effect of pH on colony morphological of Wolfiporia cocos

表6 pH 對(duì)茯苓菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.6 Effects of pH on mycelial growth vigour of Wolfiporia cocos

如表6、圖7 和圖8世紀(jì)，茯苓常規(guī)培養(yǎng)中，初始pH 在5.0～7.0 時(shí)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌絲綿密、色白，生長(zhǎng)旺盛；pH<5.0 時(shí)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度較慢，pH>7.0 時(shí)生長(zhǎng)速度快速下滑。在復(fù)壯培養(yǎng)中，初始pH 為4.0 和pH 為5.5～7.0 時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)和品質(zhì)較好，且初始pH 為4.0 時(shí)更有利于茯苓菌絲的復(fù)壯；相比之下pH 為7.5～9.0 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度較慢。說(shuō)明堿性環(huán)境不利于菌絲生長(zhǎng)。

根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速度，采用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行聚類分析。常規(guī)培養(yǎng)的聚類分析結(jié)果見圖9。

圖9 菌絲常規(guī)培養(yǎng)中不同pH 茯苓菌絲生長(zhǎng)狀況聚類圖Fig.9 The cluster diagram of mycelial growth of Wolfiporia cocos with different pH in mycelial routine culture

如圖9世紀(jì)，在菌絲常規(guī)培養(yǎng)中，11 個(gè)不同pH處理組聚為4 類，第1 類為P2、P3、P4、P5、 P6、P7，菌絲生長(zhǎng)速度為0.81～0.91 cm·d-1；第2 類為P1、P8、P9，菌絲生長(zhǎng)速度為0.72～0.77 cm·d-1；第3 類為P10，菌絲生長(zhǎng)速度為0.6 cm·d-1；第4 類為P11，菌絲生長(zhǎng)速度為0.46 cm·d-1，生長(zhǎng)較慢。方差分析結(jié)果顯示，4 類之間存在顯著性差異（P<0.05）。

復(fù)壯培養(yǎng)試驗(yàn)中的聚類分析結(jié)果見圖10。

圖10 菌絲復(fù)壯培養(yǎng)中不同pH 茯苓菌絲生長(zhǎng)狀況聚類圖Fig.10 The cluster diagram of mycelial growth of Wolfiporia cocos with different pH in mycelial rejuvenation culture

如圖10世紀(jì)，菌絲復(fù)壯培養(yǎng)中，11 個(gè)不同pH處理組聚為4 類，第1 類為P1、P4、P5、P6、P7，菌絲的生長(zhǎng)速度為0.92～0.99 cm·d-1，生長(zhǎng)最快；第2類為P3，菌絲的生長(zhǎng)速度為0.83 cm·d-1，生長(zhǎng)較快；第3 類為P10、P11，菌絲的生長(zhǎng)速度為0.39～0.48 cm·d-1，生長(zhǎng)最慢；第4 類為P2、P8、P9，菌絲的生長(zhǎng)速度為0.63～0.73 cm·d-1，生長(zhǎng)速度較慢。方差分析結(jié)果顯示，4 類之間差異顯著（P<0.05）。綜上，茯苓適合在弱酸性的環(huán)境下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果詳見表7，菌落生長(zhǎng)情況詳見圖11。

圖11 正交試驗(yàn)中茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.11 Colony morphological of routine culture of Wolfiporia cocos in orthogonal experiment

表7 茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of orthogonal experiment on conditions optimal of routine culture of Wolfiporia cocos

如表7 和圖11世紀(jì)，各因素對(duì)茯苓菌絲生長(zhǎng)速度的影響大小依次為Z>Y>W>X，最優(yōu)組合為Z2Y2W3X1，即碳源為葡萄糖、氮源為玉米蛋白粉、培養(yǎng)基初始pH 6.0、培養(yǎng)溫度31 ℃最適合茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)。除5 號(hào)培養(yǎng)皿中菌絲生長(zhǎng)緩慢，6 號(hào)菌絲稀疏外，其余培養(yǎng)皿中菌絲均潔白、綿密，且菌苔較厚。

菌絲常規(guī)培養(yǎng)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果詳見表8。

表8 方差分析Tab.8 Variance analysis

由表8 可知，碳源種類、氮源種類、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度極顯著影響菌絲的生長(zhǎng)（P<0.01）。

最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)：以最優(yōu)組合培養(yǎng)的茯苓菌絲，生長(zhǎng)速度平均為1.49 cm·d-1，高于正交試驗(yàn)中所有組的生長(zhǎng)速度；且菌絲潔白、綿密，菌苔較厚。表明葡萄糖做碳源、玉米蛋白粉做氮源、pH 6.0、培養(yǎng)溫度31 ℃是茯苓常規(guī)培養(yǎng)的最優(yōu)條件，且重復(fù)性好。

2.2.2 茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果詳見表9，菌落生長(zhǎng)情況詳見圖12。

圖12 正交試驗(yàn)中茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.12 Colony morphological of rejuvenation culture of Wolfiporia cocos in orthogonal experiment

表9 茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.9 Results of orthogonal experiment on conditions optimal of rejuvenation culture of Wolfiporia cocos

由表9 和圖12 可知，茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)中，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響大小依次為Z>W=X>Y，最優(yōu)組合為Z2W2X2Y1，即碳源為麥芽糖、氮源為蛋白胨、培養(yǎng)基初始pH 為5.5、培養(yǎng)溫度31 ℃。就菌絲生長(zhǎng)狀況而言，3 號(hào)和6 號(hào)培養(yǎng)皿中菌絲雖然生長(zhǎng)速度慢，但菌絲最綿密，菌苔較厚；7～9 號(hào)培養(yǎng)皿中菌絲生長(zhǎng)速度較快，但菌絲稀疏，菌苔較薄。

菌絲復(fù)壯培養(yǎng)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果詳見表10。

表10 方差分析Tab.10 Variance analysis

由表10 可知，碳源種類、氮源種類、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度極顯著影響菌絲的復(fù)壯（P<0.01）。

最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)：以最優(yōu)條件培養(yǎng)的茯苓菌絲，生長(zhǎng)速度平均為1.45 cm·d-1，高于正交試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組，且菌絲潔白、綿密，菌苔較厚。表明麥芽糖為碳源，蛋白胨為氮源，pH 為5.5，培養(yǎng)溫度為31 ℃是茯苓菌絲復(fù)壯培養(yǎng)最優(yōu)條件，且重復(fù)性好。

退化菌絲復(fù)壯前后的生長(zhǎng)情況對(duì)比結(jié)果詳見表11、圖13 和圖14。

圖13 復(fù)壯前后茯苓菌落形態(tài)特征Fig.13 Colony morphological of Wolfiporia cocos before and after rejuvenation

圖14 復(fù)壯前后茯苓菌絲顯微特征Fig.14 Microscopic traits of Wolfiporia cocos mycelium before and after rejuvenation

表11 復(fù)壯前后茯苓菌絲的生長(zhǎng)情況Tab.11 Mycelial growth of Wolfiporia cocos before and after rejuvenation

由表11、圖13 和圖14 可知，復(fù)壯菌絲的生長(zhǎng)速度平均為1.45 cm·d-1，相比復(fù)壯前提高了178.85%，且菌絲潔白、綿密，菌苔較厚。在400 倍下的顯微觀察結(jié)果顯示，退化的茯苓菌絲細(xì)長(zhǎng)，分叉較少；復(fù)壯后的茯苓菌絲粗壯，分叉增多，生長(zhǎng)旺盛。

3 結(jié)論與討論

在茯苓的實(shí)際生產(chǎn)中，菌種常因長(zhǎng)時(shí)間保藏發(fā)生退化，目前還缺乏解決該問(wèn)題的有效方法，這嚴(yán)重影響了茯苓的生產(chǎn)效率和品質(zhì)?，F(xiàn)代育種方法，例如原生質(zhì)體技術(shù)，可在退化菌種復(fù)壯的基礎(chǔ)上通過(guò)改良性狀，使其重新恢復(fù)生活力[5]。李云夢(mèng)等[6-7]在對(duì)平菇菌株的提純與復(fù)壯以及金針菇復(fù)壯技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，尖端分離法對(duì)菌種的復(fù)壯有較好的效果。劉小霞等[8]通過(guò)改變培養(yǎng)基碳源以復(fù)壯草菇退化菌種的試驗(yàn)，為研究茯苓的復(fù)壯提供了思路。

通過(guò)比較不同碳源、氮源、初始pH 和培養(yǎng)溫度對(duì)茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉三者相比，分別以葡萄糖、麥芽糖作為碳源更有利于茯苓菌絲的常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)；蛋白胨、玉米蛋白粉和NH4NO3三者相比，分別以玉米蛋白粉、蛋白胨聯(lián)合酵母膏作為氮源更有利于茯苓菌絲的常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)。液體培養(yǎng)研究表明，初始pH 為5.5 時(shí)最有利于茯苓菌絲的培養(yǎng)，當(dāng)初始pH 高于7.0 時(shí)，茯苓菌絲的生長(zhǎng)受到明顯抑制[9-10]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明初始pH 為6.0 有利于茯苓的常規(guī)培養(yǎng)，初始pH 為5.5 有利于菌絲復(fù)壯培養(yǎng)，當(dāng)初始pH＞7.0 時(shí)，茯苓菌絲生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制。有研究表明當(dāng)初始pH 為4.0 時(shí)有利于茯苓菌絲的復(fù)壯，可能是由于pH 稍低時(shí)更有利于刺激茯苓菌絲生理功能的恢復(fù)[6]。但較低的pH 環(huán)境會(huì)造成培養(yǎng)基不易凝固，因此條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化。此外試驗(yàn)結(jié)果表明31 ℃有利于茯苓菌絲的常規(guī)培養(yǎng)和復(fù)壯培養(yǎng)。綜上，茯苓菌絲常規(guī)培養(yǎng)的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是玉米蛋白粉；復(fù)壯培養(yǎng)的最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是蛋白胨聯(lián)合酵母膏；2 個(gè)過(guò)程均宜在弱酸環(huán)境、溫度為31 ℃條件下進(jìn)行。