田彬，楊兵，馬星宇，楊芝芝，廖建友

真核生物的基因表達幾乎都是先經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生前體mRNA（pre-mRNA），再由剪接體去除mRNA 中不編碼的內(nèi)含子，連接編碼的外顯子，使得單一的基因可以產(chǎn)生多個不同的轉(zhuǎn)錄本，從而表達不同的蛋白質(zhì)，這對于提高生命活動的復雜性無疑是至關(guān)重要的［1，2］。

pre-mRNA 的剪接由剪接體（snRNP）完成，snRNP 是一種核糖核蛋白復合體，它的核心由5 種富含尿嘧啶的小核RNA（snRNA）U1、U2、U4、U5 和U6，以及結(jié)合在其保守Sm 序列上的不同Sm 蛋白或Sm 樣蛋白組成［3-5］。盡管這些snRNA 在剪接體中等量存在，但在人類細胞中U1總體上過量［6］。這一發(fā)現(xiàn)提示我們U1 可能還發(fā)揮著mRNA 剪接工作以外的其他功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)，U1 snRNA會與轉(zhuǎn)錄因子TAF15 作用形成含或不含U1-70k 及Sm 蛋白等經(jīng)典snRNP 蛋白的兩種snRNP［7，8］，這與U1 可能存在的剪接以外的多種功能是一致的。例如，有研究報導U1能與轉(zhuǎn)錄起始因子TFIIH互作促進第一個磷酸二酯鍵的形成［9］，最廣為人知的非剪接功能就是U1 snRNP 對mRNA 3′端的遠端抑制（telescripting）作用［10，11］，可以防止mRNA 3′端被過早多聚腺苷酸化［12，13］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)U1 snRNP 廣泛調(diào)控非編碼RNA 在染色質(zhì)上的結(jié)合和移動［14］。這些潛在的非剪接功能也進一步引起了我們對于U1 在腫瘤中非剪接功能的興趣和探索。

近年來，已在不同腫瘤類型中鑒定出U1 sn-RNA 的熱點突變［15］。曾有研究表明癌細胞中U1 snRNP 的遠端抑制作用失效會引起腫瘤相關(guān)基因mRNA 的過早成熟發(fā)揮促癌作用［16］，而U1 snRNA與lncRNA 的互作也被證實與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［17］，更有研究發(fā)現(xiàn)U1 snRNA 可以調(diào)控癌基因的表達［18］，而與U1 snRNA 互作的蛋白SF3B1 和U2AF1 被報導可能是MYC 驅(qū)動的侵襲性癌癥的治療切入點［19］。由此可見不僅是U1 snRNA 本身，U1 snRNA 的互作蛋白以及它們形成的調(diào)控網(wǎng)絡也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。但目前關(guān)于U1 snRNA 及其結(jié)合蛋白在腫瘤中調(diào)控機制的研究還不多，這主要受限于對其分子功能機制的全面認知。

鑒于U1 snRNA 主要是以和蛋白質(zhì)結(jié)合的形式發(fā)揮功能，為了更全面地研究U1 snRNA 在腫瘤中的調(diào)控機制，我們利用ChIRP-MS（chromatin isolation by RNA purification and masss pectrmetry）技術(shù)對腫瘤細胞中U1 snRNA 所結(jié)合的所有RNA結(jié)合蛋白（RBP）進行了鑒定，從而建立了U1 snRNA在腫瘤細胞中的相互作用蛋白組圖譜，并系統(tǒng)解析了U1 snRNA 所參與的調(diào)控通路和生物學過程，進一步為腫瘤的診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CHIRP-MS

1.1.1 探針設(shè)計 根據(jù)在NCBI 網(wǎng)站上查詢到的人 源U1 snRNA 序 列 在https：//www.biosearchtech.com/chirpdesigner/上設(shè)計探針。

表1 U1 snRNA 探針序列和qPCR 引物序列

1.1.2 細胞交聯(lián)和裂解 經(jīng)消化計數(shù)后，取2 ×108個Hela 細胞，加入PBS 配制的3%甲醛溶液重懸細胞，室溫交聯(lián)30 min，再加入甘氨酸（glycine）使終濃度為0.125 M，混勻后室溫放置5 min 終止交聯(lián)。4℃離心棄上清。預冷PBS 洗一次，離心棄上清。隨后，加入細胞沉淀10 倍體積且含有蛋白酶抑制劑和RNA 酶抑制劑的Lysis Buffer（0.05 M Tris-HCl pH：7.0，0.1 mM EDTA，1% SDS），重懸混勻。以30 s on，45 s off 的參數(shù)來超聲細胞懸液。吸取2～5 μL 超聲產(chǎn)物跑瓊脂糖膠，若DNA 大小在100～500 bp，則進行后面的步驟；若DNA 片段大于500 bp則補加2～3個cycle直至片段大小合適為止。

1.1.3 探針雜交 將超聲樣品離心取上清。取1%作為Input 對照。向細胞裂解液中按照每毫升Lysis Buffer 加 入2 mL Hybridization Buffer（750 mM NaCl，1% SDS，0.05 M Tris-HCl pH：7.0，1 mM EDTA pH：8.0，15%甲酰胺）。加入10 μL 提前用100 μL Lysis Buffer 清洗過三次的C-1 beads（invitrogen），在雜交爐中37 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。去除珠子，取蛋白上清按每毫升體積加入1 μL 100 μM 探針雜交過夜。將過夜后的蛋白上清加入到100 μL C-1 beads，37 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。用Wash Buffer（2×SSC，0.5%SDS）清洗磁珠5 次。最后加入磁珠等 體 積 的Wash Buffer，取10 μL 樣 品 用 于 提 取RNA。剩下所有樣品用于獲取蛋白。

1.1.4 獲取U1 snRNA 結(jié)合蛋白 將含有上一步樣品的EP 管置于磁力架上1 min 后，棄去上清，加入等體積的Biotin elution Buffer（12.5 mM D-Biotin、7.5 mM HEPES pH：7.5、75 mM NaCl、1 mM EDTA pH：8.0，0.15% SDS、0.075% sarkosyl、0.02% Na-Deoxycholate、6.4 mM NaOH），渦旋后室溫靜置20 min，65℃干浴1 h，收集上清。再次加入與磁珠等體積的Biotin elution Buffer，重復操作，合并兩次獲得的上清，加入4 倍體積預冷丙酮，-20 ℃沉淀過夜。

1.1.5 樣品 質(zhì)譜前處理4℃離心棄上清，分別加入70%乙醇和冷丙酮各洗一次。加入UA buffer（8 M Urea，100 mM Tris-HCl）回溶蛋白，室溫震蕩2 h 后，加入二硫蘇糖醇DTT 30 ℃1 h 還原蛋白，接著加入碘乙酰胺IAA 室溫45 min 烷基化蛋白，再加入質(zhì)譜級的trypsin 37 ℃酶解過夜。第二天加入10%TFA 終止酶解，懸干后進行脫鹽處理，最后上機檢測所富集到的蛋白。

1.2 RNA 提取與RT-qPCR

向之前預留的10 μL Input 和10 μL 雜交后樣品中分別加入85 μL RNA PK Buffer（100 mM Na-Cl、10 mM Tris-HCl pH：8.0、1 mM EDTA pH：8.0、0.5%SDS）和5 μL Proteinease K，在水浴鍋中45℃孵育45 min。加入DEPC 水補齊體積200 μL，再分別加入200 μL 氯仿和200 μL 水飽和酚，充分渦旋后13 000 r/min，4 ℃離心10 min。取上清加入25 μL 3M NaAc，0.5 μL 糖原（Glycogen Blue），3 倍體積無水乙醇，-80 ℃沉淀過夜。13000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清，95%乙醇洗一次，風干后用少量DEPC 水回溶。使用諾唯贊qPCR 試劑盒在qPCR儀（BIO-RAD）進行qPCR。檢測目標U1 snRNA 和陰性對照GAPDH 的豐度。

1.3 蛋白跑膠銀染

取部分蛋白上清加入5×loading buffer，99℃變性5min 后做聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后用銀染固定液在搖床上60～70 rpm 室溫固定40 min 以上，依次經(jīng)100 mL 30%乙醇、200 mL 雙蒸水洗滌10 min后放入銀染增敏液，2 min 后用200 mL 雙蒸水洗滌兩次，每次1 min，放入銀溶液銀染10 min 后再洗滌一次后放入銀染顯色液顯色至顯色效果合適時放入顯色終止液終止顯色。所有銀染試劑來自碧云天快速銀染試劑盒（P0017S）。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

將我們獲取到的已知U1 snRNA 結(jié)合蛋白與新檢測到的U1 snRNA 結(jié)合蛋白結(jié)合起來按照質(zhì)譜結(jié)果中的score 進行排序，將所有的基因在http：//cpdb.molgen.mpg.de/網(wǎng)站進行了GO、KEGG、Complex 分析，其中，GO 選取了在生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個方面的Top10進行繪圖；Complex復合物選取了Reactome進行結(jié)果展示；KEGG 的分析結(jié)果整理在表中。同時，我們選取了score＞50 的蛋白進行了stringdb https：//cn.string-db.org 網(wǎng)絡互作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hela 細胞內(nèi)源性U1 snRNP 的高效捕獲

CHIRP-MS（comprehensive identification of RNAbinding proteins by mass spectrometry）是一種系統(tǒng)地檢測與RNA 互作的所有蛋白質(zhì)的新技術(shù)［20］，我們通過甲醛交聯(lián)的方式使U1 snRNA 與其互作的蛋白質(zhì)形成緊密結(jié)合的交聯(lián)復合體，進一步利用帶有生物素標記的U1 snRNA 核酸探針和能與生物素特異性結(jié)合的鏈霉親和素磁珠將U1 snRNA及其結(jié)合的蛋白質(zhì)一起分離出來。為了確認U1 snRNA 探針的捕獲效率，我們?nèi)〕隽瞬糠蛛s交后的樣品，用蛋白酶K 去除結(jié)合的蛋白，再純化捕獲到的U1 snRNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進行qPCR 實驗（圖1）。為了確定最佳探針用量，我們評估了不同用量探針的富集效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著探針用量的增加，捕獲到的內(nèi)源U1 snRNA 也更多（圖2A），這進一步說明了我們使用的探針具有非常強的特異性。實驗結(jié)果顯示在探針用量在100 pmol/107個細胞的時候具有最佳的U1 snRNA富集效率，因此后續(xù)實驗我們探針用量為100 pmol/107個細胞。隨后，我們通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染評估了不同廠家甲醛的交聯(lián)效果，發(fā)現(xiàn)用Sigma 甲醛交聯(lián)細胞可以獲得更多的U1 snRNA 互作蛋白，且得到的蛋白量與交聯(lián)時間無關(guān)（圖2B）。最后我們利用探針富集了腫瘤細胞Hela 的U1 snRNA，qPCR 的結(jié)果證實我們使用的探針具有很好的富集效果，我們用CHIRP 獲得的信號除以Input 樣品中的信號，發(fā)現(xiàn)能夠富集到98.67%的Hela 細胞的內(nèi)源U1 snRNA，而NC 探針幾乎富集不到內(nèi)源U1 snRNA，同時我們檢測了探針捕獲完蛋白后剩下的上清裂解液中U1 與GAPDH 的含量，發(fā)現(xiàn)未被探針富集到的U1 很少，說明我們的探針捕獲效率很高（圖2C）。將探針富集到Hela U1 snRNA 結(jié)合蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染，結(jié)果顯示U1 探針捕獲的蛋白能染出多條蛋白條帶，而NC 探針組幾乎染不出蛋白條帶，這說明我們使用的U1 探針能有效捕獲Hela細胞U1 snRNA 的結(jié)合蛋白（圖2D）。

圖1 CHIRP-MS 流程與生信分析

圖2 U1 snRNA 探針富集效率檢測與實驗條件優(yōu)化

2.2 LC-MS 揭示Hela 細胞的U1 snRNA 互作蛋白圖譜

為了揭示Hela 細胞中U1 snRNA 的互作蛋白圖譜，我們將U1 和NC 探針捕獲到的蛋白利用丙酮進行沉淀和純化，經(jīng)過酶解和進一步純化后利用LC-MS 技術(shù)進行蛋白圖譜鑒定（圖1）。對質(zhì)譜獲得的蛋白信息進行篩選，保留達到兩個肽段以上的U1 snRNA 結(jié)合蛋白，以及在U1 探針組中的肽段數(shù)相比NC 探針組肽段數(shù)大于10 倍的結(jié)合蛋白，最終我們一共獲得135 個蛋白，其中包括60 種已知的snRNA 結(jié)合蛋白（表格2）和75 種新的sn-RNA 結(jié)合蛋白（表格3）。我們的研究在國際上首次系統(tǒng)揭示了U1 snRNA 在腫瘤細胞中的結(jié)合蛋白圖譜，為研究U1 snRNA 的生物學功能和其調(diào)控腫瘤的分子機制提供了便利。

表2 LC-MS 在Hela 細胞中檢測到的60 個已知的U1 snRNA 互作蛋白

2.3 腫瘤細胞中U1 協(xié)調(diào)調(diào)控RNA 剪接、端粒和DNA 甲基化等多個生物學過程

為了研究U1 snRNA 在腫瘤細胞中的功能，我們對質(zhì)譜檢測到的U1 snRNA 結(jié)合蛋白進行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析的結(jié)果顯示，在細胞組成方面（圖3A），富集到的U1 snRNA 結(jié)合蛋白除了參與剪接復合體，核小核糖核蛋白復合物以及Sm 樣蛋白復合物的形成，還包括細胞器內(nèi)腔蛋白，細胞膜結(jié)合的細胞器蛋白以及胞外囊泡相關(guān)蛋白，這提示U1 snRNA 可能與囊泡運輸這一生物學過程相關(guān)。同時，我們還發(fā)現(xiàn)U1 互作蛋白還參與了端粒酶全酶復合物和甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的形成，這對于維持細胞染色體穩(wěn)定性和活性以及表觀遺傳調(diào)控都是非常重要的，由此不難看出U1 snRNA 與染色體的多重互作，進一步說明其在腫瘤細胞生長過程中潛在的重要作用。此外，端粒延長抑制也是腫瘤治療的策略之一。經(jīng)過對U1 snRNA 互作蛋白參與的生物學過程分析（圖3B），我們發(fā)現(xiàn)U1 富集到的蛋白主要參與含環(huán)化合物、含氮化合物及高分子化合物等有機化合物的代謝過程，同時也和核糖核蛋白復合物生物發(fā)生、RNA定位及細胞內(nèi)運輸有關(guān)，結(jié)合細胞組分的分析結(jié)果，這說明U1 很可能以囊泡運輸?shù)姆绞浇閷Я思毎麅?nèi)RNA 加工、組裝至運輸和定位的整個過程。最后，通過對于這些富集蛋白進行分子功能的分析（圖3C），我們發(fā)現(xiàn)U1 snRNP 會與核酸、蛋白和酶結(jié)合，這進一步揭示了其分子功能的多樣性。接著，我們對U1 snRNA 互作蛋白做了KEGG 分析（圖3D），發(fā)現(xiàn)除了顯著富集到剪接體通路外，還富集到了核糖體通路和肌醇磷酸鹽代謝通路，這一方面說明U1 snRNP 與核糖體生物發(fā)生相關(guān)，另一方面也突出了其在細胞代謝中的重要作用。此外，還富集到了疾病相關(guān)通路，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥、沙門氏菌感染和冠狀病毒病相關(guān)通路，這不僅揭示了U1 在分子和細胞水平的功能多樣性也提示我們U1 可能參與了包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的潛在機制。

圖3 Hela 細胞U1 snRNA 互作蛋白的GO 分析與KEGG 分析

表3 LC-MS 在Hela 細胞中檢測到的75 個新的U1 snRNA 互作蛋白

2.4 U1 互作蛋白網(wǎng)絡構(gòu)建揭示EWSR1 等蛋白介導其腫瘤調(diào)控功能

最后，我們對U1 互作蛋白做了蛋白復合體分析（圖4A）和PPI 網(wǎng)互作分析（圖4B）。蛋白復合體分析顯示主要富集到一些剪接體復合物如U1 snRNP、U4 snRNP、U4：U5：U6 tri-snRNP complex等。而網(wǎng)絡互作分析結(jié)果顯示U1 富集蛋白之間存在非常復雜的聯(lián)系。主要包含SRSF 蛋白家族、HNRNP 蛋白家族、SNRP 蛋白家族和核糖體蛋白，這些蛋白功能都與RNA 加工、代謝以及核糖體組裝相關(guān)。值得注意的是，在與U1 snRNP 緊密相關(guān)的蛋白中包括EWSR1 和RBMX，EWSR1 是一種多功能蛋白，參與多種細胞過程，包括基因表達、細胞信號傳導、RNA 加工和運輸。該基因與編碼轉(zhuǎn)錄因子的各種基因之間的染色體易位導致產(chǎn)生參與腫瘤發(fā)生的嵌合蛋白。該基因的突變已知會導致尤因肉瘤以及神經(jīng)外胚層和各種其他腫瘤［21］。而RBMX在精子發(fā)生中進化出男性特有的功能［22］，這增加了我們對U1 snRNP 新功能的認識。從蛋白復合體富集分析和PPI 網(wǎng)絡分析的結(jié)果我們得出結(jié)論，U1 snRNP 在腫瘤細胞中存在廣泛而重要的分子調(diào)控機制。

圖4 蛋白復合體富集分析和PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建揭示U1 snRNP 的廣泛調(diào)控機制

3 討 論

生物從核酶時代進化到蛋白酶時代，雖然RNA 依舊在許多重要的生命過程中發(fā)揮著關(guān)鍵且獨立的催化活性，例如RNase P 的核心RNA［23］以及核糖體RNA［24，25］，但蛋白質(zhì)在細胞生命活動的各個環(huán)節(jié)已經(jīng)發(fā)揮著越來越重要的作用［26，27］，可以說沒有RBP，RNA 將寸步難行，因此研究RNA所結(jié)合的RBP 對于研究RNA 在腫瘤中的功能和揭示生命本質(zhì)具有非常重要的價值。我們利用CHIRP-MS 技術(shù)建立了國際上第一個腫瘤細胞U1互作蛋白圖譜，為研究U1 的腫瘤生物學功能和調(diào)控機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。

在本研究中鑒定到了60 個已知的U1 互作蛋白，同時還發(fā)現(xiàn)了75個新的U1結(jié)合蛋白，這些新發(fā)現(xiàn)的U1結(jié)合蛋白中許多都和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相 關(guān)，例 如ACTB、HNRPK、RBMX、DDX17 等。ACTB 通常在大多數(shù)腫瘤細胞和組織中被上調(diào)，其異常表達和聚合以及由此引起的細胞骨架變化被揭示與癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［28］；HNRPK 被報導在慢性粒細胞白血病（CML）中會被BCR/ABL 癌蛋白通過激活MAPK（ERK1/2）途徑增加表達和活性，從而促進MYC 的翻譯［29］；RBMX 不僅與轉(zhuǎn)移性膀胱癌等各種腫瘤的惡性進展相關(guān)［30］還是小鼠和人類髓系白血病發(fā)生所必需的［31］；DDX17 也被發(fā)現(xiàn)能促進肝細胞癌和肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移［32，33］。這些新的發(fā)現(xiàn)將為我們進一步研究U1 snRNA 參與腫瘤形成和發(fā)展的分子機制提供新思路。

在后續(xù)GO 分析和KEGG 分析，我們發(fā)現(xiàn)U1 snRNA 結(jié)合蛋白除了經(jīng)典的剪接復合體蛋白還包括細胞器、細胞膜以及囊泡蛋白，而BP 也富集到了RNA 定位與細胞內(nèi)運輸?shù)壬飳W過程，這說明U1 snRNA 在RNA 的加工、運輸和定位過程中發(fā)揮著協(xié)調(diào)統(tǒng)一的調(diào)控作用。這不僅和癌基因的轉(zhuǎn)錄本成熟以及功能密不可分，還影響到腫瘤相關(guān)的lncRNA、circ RNA、miRNA 等非編碼RNA 的成熟，這些非編碼RNA 在腫瘤進展中也發(fā)揮著十分重要的作用。例如，對腫瘤樣本的全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了大量與各種類型癌癥相關(guān)的lncRNA，lncRNA 表達及其突變可能促進或抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移［34］；許多circRNA 也被證實通過不同的分子機制在不同程度上參與癌癥的促進或抑制［35］；而miRNA 除了在各種腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮促癌或抑癌作用［36］，在癌癥微環(huán)境調(diào)控、化療耐藥、免疫調(diào)節(jié)等方面同樣發(fā)揮著功能［37］。令我們意外的是U1 富集蛋白參與了端粒酶全酶復合物及甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的形成，之前就有研究報導U1 snRNP 介導lncRNA 與染色質(zhì)的互作［14］，同時U1 snRNP 也被報導會調(diào)控Pol ll 的轉(zhuǎn)錄［38］。我們的研究說明U1 可能會直接與染色質(zhì)互作，并可能影響到染色體的復制和基因的表達，而之前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了U1 的突變或表達上調(diào)，進一步提示我們在腫瘤細胞U1 可能從表觀遺傳的角度改變腫瘤細胞的命運。另外，U1 結(jié)合蛋白富集到的多種疾病相關(guān)通路既揭示了U1 廣泛的生物學功能也暗示其作為包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病治療靶點的潛在價值。總之，我們的研究為進一步擴大U1可能的生物學功能提供了基礎(chǔ)，也為進一步研究U1 參與腫瘤發(fā)展的機制以及腫瘤的防治提供了新的思路。