宋攀，伍韜瑋，程坦，王靜怡，韓萍

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous carcinoma，HNSCC）是全球第六大最常見癌癥，年新增890000 病例，死亡450000 人，頭頸鱗癌的發(fā)病率逐年上升，預(yù)計到2030 年，年新增病例將達(dá)108 萬［1-3］。對約30%～40%的早期患者而言，單純手術(shù)或放療可取得較好療效，但約60%的患者就診時已為局部晚期，采用手術(shù)、放療和化療在內(nèi)綜合治療，五年生存率為50%～55%［4-6］，局部和/或區(qū)域復(fù)發(fā)率為45%和50%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為20%［7］。因此，進(jìn)一步揭示頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動基因，明確可能的作用機(jī)制，具有重要的意義。

卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)ST）是一種單鏈糖基化蛋白，在肝臟、腎臟、骨骼等多種正常組織中均有表達(dá)［8］。由于它最早被發(fā)現(xiàn)能抑制卵泡刺激素的分泌，因此被命名為卵泡抑素。FST 蛋白含有TGFβ 結(jié)合位點(diǎn)，主要作為TGFβ 蛋白家族的抑制劑而發(fā)揮功能。TGFβ 家族如激活素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白和生長分化因子等均能夠和FST 結(jié)合［9］。FST 在胃癌、肺癌、口腔癌等實體腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)［10，11］。在實體腫瘤中，F(xiàn)ST 的主要功能也是抑制TGFβ 家族活性，參與腫瘤細(xì)胞干性，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及侵襲遷移等能力的調(diào)節(jié)過程，在不同腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用。因此FST 對于實體腫瘤的影響很大程度取決于腫瘤類型，而在頭頸鱗癌中，F(xiàn)ST 與腫瘤生物學(xué)特性的關(guān)系仍有待研究。

本研究擬通過Transwell 侵襲遷移實驗、克隆形成、CCK8 以及裸鼠皮下成瘤實驗重點(diǎn)探討FST對頭頸鱗癌腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移、增殖等生物學(xué)特性的影響。通過FST 敲低的腫瘤細(xì)胞的RNA 測序分析，對FST促癌作用的潛在機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人口腔上皮細(xì)胞HOK 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；頭頸鱗癌細(xì)胞株包括：人咽鱗癌細(xì)胞Fadu、人喉癌細(xì)胞Tu686、人口腔鱗癌細(xì)胞HSC-3。Fadu 與HSC-3 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；Tu686 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 實驗動物

采用5～6 周齡的BALB/c 裸鼠，體重18～20 g，微生物級別為SPF 級。在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院動物實驗平臺隔離飼養(yǎng)。環(huán)境：在溫度25～27℃、濕度45%～50%、高度除塵除菌的新鮮空氣以及無特殊病原體的環(huán)境中飼養(yǎng)，供應(yīng)無菌水和飼料自由攝入。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELASA）

采用Human FST ELISA Kit（ELK Biotechnology，中國）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中FST 分泌量，在ELISA板孔中加入梯度稀釋的100 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品液或100 μL 的樣品液，37 ℃孵育80 min。孵育結(jié)束后用洗滌液緩沖液重復(fù)清洗3 次；每孔加入100 μL生物素化抗體工作液，于37 ℃孵育50 min，孵育結(jié)束后洗滌3 次；每孔加入100 μL 鏈霉親和素-HRP工作液于37 ℃孵育50 min，孵育結(jié)束后洗滌5 次；每孔加入90 μL TMB 底物溶液于37 ℃避光孵育20 min，加入50 μL 終止液，使用酶標(biāo)儀測定對應(yīng)孔在450 nm 波長下的吸光值。

1.4 細(xì)胞RNA 提取和實時熒光定量PCR（qRTPCR）

使用RNA 快速提取試劑盒（RNA Quick Purificationkit）（奕杉生物，中國）從細(xì)胞中提取總RNA；應(yīng)用PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；再以cDNA為模板，用TB Green?Premix Ex TaqTMII（Takara，日本）進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。首先計算ΔCt=目的基因的Ct 值-內(nèi)參基因的Ct 值均數(shù)，目的基因的相對表達(dá)量=2-ΔCt。本研究所用的引物見表1：

表1 qRT-PCR 引物

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將需要進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種于6 孔板中，次日待細(xì)胞貼壁良好且覆蓋度達(dá)50%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；用于敲低FST 的siRNA 及shRNA 慢病毒載體均購自艾基生物技術(shù)有限公司（廣州），使用siRNA 構(gòu)建瞬轉(zhuǎn)敲低FST 的Tu686 和HSC-3細(xì)胞株，由siRNAsuperTM（艾基生物，中國）轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染；使用shRNA 慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定敲低FST 的HSC-3 細(xì)胞株。

1.6 FST-siRNA 序列（表2）

表2 1.6 FST-siRNA 序列

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）

細(xì)胞培養(yǎng)皿用PBS 清洗3 次，加入RIPA 冰上裂解15 min，收集細(xì)胞蛋白，使用BCA 法檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度用4×Loading Buffer 配平上樣量，配制SDS-PAGE 膠并進(jìn)行凝膠電脈；電泳結(jié)束后將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)至PVDF 膜；使用5%BSA 室溫封閉1 h 后孵育一抗，4 ℃搖床過夜；次日使用TBST 清洗PVDF 膜10 min×3 次，加入二抗于室溫條件下孵育1 h，TBST 清洗10 min×3 次；最后使用曝光液在曝光機(jī)內(nèi)曝光。

1.8 克隆形成實驗

將腫瘤細(xì)胞按500個/孔鋪于6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，約3～5 d 后顯微鏡下觀察克隆形成情況并更換新鮮培養(yǎng)基；鏡下觀察當(dāng)每個克隆有50個細(xì)胞左右大小時，棄去培養(yǎng)基，使用PBS 清洗3 遍，加入甲醇固定20 min，使用0.3%結(jié)晶紫染色20 min，用自來水清洗一次；最后拍照并計數(shù)克隆數(shù)目。

1.9 細(xì)胞侵襲、遷移實驗

取24 孔 板，每 孔 加 入500 μL 含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基，將Transwell 小室放入孔中。在小室內(nèi)加入500 μL 不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，在每孔中種入5×104個腫瘤細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；用鑷子取出小室，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗后甲醇固定30 min；使用0.3%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦去上室底部的細(xì)胞；使用顯微鏡拍照并計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.1 0 Cell Counting Kit-8（CCK-8）實驗

胰蛋白酶消化離心收集細(xì)胞，后調(diào)整細(xì)胞密度以5000 個細(xì)胞/100 μL 接種于96 孔板內(nèi)，每個處理組均設(shè)4 個復(fù)孔，分別在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h 時間點(diǎn)，向96 孔板中加入10 μL CCK-8試劑，于CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標(biāo)儀上測量450 nm 波長處的吸光度（OD）值；根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞生長曲線。

1.1 1 裸鼠皮下成瘤實驗

細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)增到一定數(shù)量后，消化細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按3×106/100 μL 重懸于生理鹽水中，移入無菌EP 管，用冰盒將細(xì)胞帶至動物房；用胰島素針吸取100 μL 細(xì)胞懸液平行刺入裸鼠右側(cè)后背皮下，按每只裸鼠100 μL 注射，繼續(xù)飼養(yǎng)；每5 天觀察、量度并記錄一次裸鼠皮下瘤生長情況。4 周后處死小鼠，取腫瘤拍照。

1.1 2 統(tǒng)計分析

所有分析均采用SPSS Statistics 24.0 軟件和GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行。每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)，采用t檢驗分析組間差異的顯著性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 敲低FST 的HSC-3、Tu686 細(xì)胞株構(gòu)建

通過WesternBlot 和qRT-PCR 實驗，顯示Fadu、Tu686 以及HSC-3 細(xì)胞中FST 在mRNA 和蛋白表達(dá)水平相較于正常口腔上皮細(xì)胞HOK 顯著增加（圖1A，B）。為了研究FST 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，我們在FST 表達(dá)較高的Tu686 與HSC-3 細(xì)胞中使用siRNA 敲低了FST 的表達(dá)，通過qRT-PCR和Western Blot 驗證了敲低效率（圖1C-F），結(jié)果顯示，敲 低FST 的HSC-3 和Tu686 細(xì) 胞 中FST 的mRNA 及蛋白表達(dá)較對照組顯著降低。同時，作為分泌蛋白，HSC-3 和Tu686 細(xì)胞培養(yǎng)上清中FST的分泌量較對照組也顯著下降（圖1G，H）。

圖1 在HSC-3 和Tu686 細(xì)胞株中敲低FST 的表達(dá)

接下來我們進(jìn)一步在HSC-3 細(xì)胞中使用shRNA 穩(wěn)定敲低了FST 的表達(dá)，qRT-PCR 和Western Blot 結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲低FST 的HSC-3 細(xì)胞中FST的mRNA、蛋白表達(dá)水平較對照組均顯著下降（圖1I，J）。

2.2 敲低FST 對Tu686 和HSC-3 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

為了研究敲低FST 對頭頸鱗癌生物學(xué)特性的影響，我們首先從細(xì)胞侵襲和遷移方面開展了研究，結(jié)果顯示：敲低FST 的HSC-3 及Tu686 細(xì)胞穿過Transwell 小室的數(shù)量較對照組顯著減少（圖2A～D）。在穩(wěn)定敲低FST 的HSC-3 細(xì)胞株中侵襲遷移實驗穿過小室的細(xì)胞數(shù)目同樣明顯減少（圖2E、F）。以上結(jié)果提示敲低FST 后腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力減弱。

2.3 敲低FST 對Tu686 和HSC-3 細(xì)胞增殖能力的影響

除了侵襲遷移之外，我們還研究了FST 對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，在克隆形成實驗中，敲低FST 的HSC-3 及Tu686 細(xì)胞形成的克隆的數(shù)量較對照組減少（圖3A，B）。CCK8 實驗證明敲低FST后細(xì)胞增殖速度較對照組減慢（圖3C）。隨后，我們應(yīng)用穩(wěn)定敲低FST 的HSC-3 細(xì)胞與對照組細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實驗，結(jié)果顯示FST 敲低組裸鼠移植瘤體積增長顯著高于對照組（圖3D），這表明敲低FST 能增強(qiáng)頭頸鱗癌在裸鼠體內(nèi)的增殖及成瘤能力。

圖3 敲低FST 后腫瘤細(xì)胞增殖能力減弱

2.4 FST 影響腫瘤侵襲、遷移、增殖的機(jī)制探討

為了研究FST 導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲遷移及增殖能力減弱的機(jī)制，我們對穩(wěn)定敲低FST 的HSC-3細(xì)胞和對照組細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，通過差異基因分析我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞敲低FST 后表達(dá)上調(diào)的基因有583 個，表達(dá)下調(diào)的基因有265 個。我們對差異表達(dá)的基因進(jìn)行了基因組百科全書通路富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）。在KEGG 信號通路上主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞粘附和吞噬體等信號通路，同時TGFβ 信號通路也有顯著富集（圖4A）。

圖4 HSC-3 細(xì)胞敲低FST 后測序結(jié)果差異基因的KEGG 分析

由于FST 的主要功能是結(jié)合并失活TGFβ 家族的蛋白，在我們的測序數(shù)據(jù)中，首先關(guān)注到了TGFβ 信號通路的富集情況，結(jié)果顯示共有10 個差異表達(dá)的基因富集在TGFβ 信號通路（圖4B）。

我們用qRT-PCR 對差異表達(dá)的基因進(jìn)行了驗證，SMAD 特異性E3 泛素蛋白連接酶2（SMAD Specific E3 Ubiquitin Protein Ligase 2，SMURF2）在FST 敲低組表達(dá)上調(diào)，與測序結(jié)果相反，其他基因的驗證結(jié)果與測序數(shù)據(jù)基本一致。轉(zhuǎn)化生長因子β2（transforming growth factor beta 2，TGFB2）、DNA結(jié)合抑制因子3（inhibitor of DNA binding 3，ID3）、抑制素βE（inhibin subunit beta E，INHBE）、骨形成蛋白7（Bone Morphogenetic Protein 7，BMP7）的表達(dá)量極低，在HSC-3 細(xì)胞FST 敲低組和對照組中未檢測到表達(dá)；核心蛋白聚糖（Decorin，DCN）、FST、血小板反應(yīng)蛋白1（Thrombospondin 1，THBS1）、反義導(dǎo)向分子（Repulsive Guidance Molecule BMP Co-Receptor B，RGMB）在FST 敲低組表達(dá)下降；DNA結(jié)合抑制因子1（Inhibitor Of DNA Binding 1，ID1）基因的變化最顯著，在FST 敲低組中表達(dá)顯著上調(diào)（圖5A）。

圖5 TGF-β 信號通路的驗證及FST 對腫瘤凋亡的影響

目前在胰腺癌的研究中主要認(rèn)為ID1 是促癌因子，能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。于是我們進(jìn)一步研究了敲低FST 對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，我們發(fā)現(xiàn)敲低FST 后HSC-3 細(xì)胞凋亡率增加（圖5B），凋亡相關(guān)蛋白caspase3 表達(dá)增加（圖5C）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ST 可能通過影響腫瘤細(xì)胞干性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移以及增殖。

3 討 論

既往研究報道，F(xiàn)ST 在胃癌、肺癌、口腔癌等實體腫瘤組織中存在異常表達(dá)［10，11］，在不同腫瘤中分別發(fā)揮促癌或抑癌作用，與腫瘤細(xì)胞干性，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及侵襲能力等有關(guān)。在實體腫瘤中，F(xiàn)ST 的主要功能是抑制TGFβ 家族蛋白的活性，TGFβ 家族如激活素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白和生長分化因子等均能夠和FST 結(jié)合，其中激活素A 對FST 的親和力最高，F(xiàn)ST 也主要通過抑制激活素A的活性而發(fā)揮作用［9］。在胰腺癌和肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)FST 通過抑制激活素A 活性導(dǎo)致腫瘤干性降低，從而增強(qiáng)化療敏感性［12，13］；在胰腺癌的研究中還發(fā)現(xiàn)FST 通過抑制激活素A 活性導(dǎo)致腫瘤侵襲遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力減弱［14，15］。此外，一項在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，在異種移植模型中，F(xiàn)ST過表達(dá)通過上調(diào)RET、IL2RA 和CCL5 增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力［16］，這提示在FST的促腫瘤作用中可能存在其他不依賴Act-A的機(jī)制。

FST 在頭頸鱗癌研究較少，在口腔鱗癌有報道顯示FST高表達(dá)的患者腫瘤具有較晚的臨床分期與疾病的OS及FDS 無關(guān)［11］，F(xiàn)ST能通過抑制激活素A的活性抑制口腔鱗癌血管生成［17］。而FST對于頭頸鱗癌生物學(xué)特性的影響仍有待研究。我們通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，敲低頭頸腫瘤細(xì)胞FST 表達(dá)能夠減弱腫瘤侵襲遷移和增殖能力，測序分析發(fā)現(xiàn)差異的基因在包括TGFβ 信號通路在內(nèi)的多條信號通路均有顯著富集。考慮到FST 在功能上與TGFβ家族蛋白聯(lián)系較為緊密，我們首先選擇了TGFβ 信號通路進(jìn)行研究。在腫瘤發(fā)生早期，TGFβ 信號通路具有抑制腫瘤的功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，在腫瘤發(fā)展的晚期，TGFβ信號通路激活可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，侵襲遷移和化療耐藥［18］。TGFβ 信號在腫瘤中的雙重功能和多向性使其成為一個具有挑戰(zhàn)性的治療靶標(biāo)。

在TGFβ 信號通路富集到的差異表達(dá)基因中，我們通過qRT-PCR 驗證發(fā)現(xiàn)ID1 的變化最為顯著。ID1 是細(xì)胞周期和細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子，能夠通過與其他轉(zhuǎn)錄因子聚合并抑制其與DNA 的結(jié)合從而抑制DNA 轉(zhuǎn)錄。生理情況下，ID1 嚴(yán)格調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)和細(xì)胞分化［19，20］。在腫瘤中，ID1 在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種癌癥中過表達(dá)，并通過不同途徑對這些腫瘤發(fā)揮促癌作用，包括促進(jìn)腫瘤血管生成和侵襲遷移、促進(jìn)腫瘤化療耐藥和靶向治療耐藥等［21-23］。然而，目前也存在一些有爭議的結(jié)果，例如非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)ZEB1-AS1 通過抑制ID1 的表達(dá)降低腫瘤細(xì)胞凋亡率，因此ID1 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［24］。在頭頸鱗癌中，目前主要認(rèn)為ID1發(fā)揮促癌作用，ID1 在腫瘤組織表達(dá)顯著上調(diào)，敲低ID1 的表達(dá)顯著降低了頭頸鱗癌的成瘤能力［25］。在我們的研究中，敲低FST 后腫瘤細(xì)胞ID1 表達(dá)增加，同時腫瘤干性降低，這與之前的一些研究存在一定的矛盾。所以ID1 在前頭頸鱗癌中的作用仍需要深入研究。

本研究仍有一些不足之處，本章節(jié)所用的細(xì)胞株FST 表達(dá)水平均較高，因此過表達(dá)FST 細(xì)胞株的構(gòu)建效果并不理想，我們并未補(bǔ)充過表達(dá)FST 對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性影響的結(jié)果，未來應(yīng)該在更多的頭頸鱗癌細(xì)胞株重復(fù)實驗，同時完善FST 過表達(dá)相關(guān)的內(nèi)容?？傊?，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲低FST 的表達(dá)能夠抑制腫瘤侵襲遷移以及增殖能力，具體機(jī)制可能與TGFβ 信號通路以及腫瘤細(xì)胞干性減弱有關(guān)。