范輝陽，賴義明，周杰，陳勇明，唐晨，李凌峰，吳永鑫，郭正輝

世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國，前列腺癌（PC）發(fā)病率超過肺癌到了第一的位置，亞洲發(fā)病率遠低于歐美，但是整體處于上升趨勢［1］。世界衛(wèi)生國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020 癌癥數(shù)據(jù)顯示男性癌癥新發(fā)病例中前列腺癌占比14.1%，僅次于肺癌［1］。前列腺癌早期的治療選擇廣泛，主要包括手術治療、內(nèi)分泌治療、放療和化療，且預后較好（五年生存率接近100%）［2］，前列腺癌晚期治療選擇少且效果差（五年生存率降至28%）［3-5］。對于晚期前列腺癌，其轉(zhuǎn)移病例中，骨轉(zhuǎn)移占比超過80%［6］。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的過程涉及許多通路的調(diào)控及外部環(huán)境的改變，包括PTEN 通路，AKT 通路等，以及細胞外基質(zhì)的反應性，腫瘤微環(huán)境，免疫微環(huán)境，腫瘤細胞代謝異常均與腫瘤的進展密切相關［7］。但是缺乏具體深入的相關研究，因此，進一步地探究前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關調(diào)控機制，可為臨床上治療前列腺癌提供新的理論依據(jù)。

RAI14 也稱為NORPEG，RAI13，是一種新穎的蛋白質(zhì)編碼基因，包含6 個錨蛋白重復序列和2 個線圈螺旋結構域［8］。研究表明，RAI14 在許多人體組織中表達，其功能與細胞骨架密切相關。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RAI14 可以在多種惡性腫瘤中高表達，包括胃癌［9-11］，肺癌［12］，卵巢癌［13］和前列腺癌［14］，與腫瘤的惡性進展呈正相關。在這些惡性腫瘤中RAI14 的高表達與腫瘤藥物的耐藥性反應以及腫瘤細胞的增殖和侵襲顯著相關。

本研究擬通過生信分析，統(tǒng)計分析以及相關體外實驗探究RAI14 在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用以及相關通路、機制，以期找到前列腺癌進展的作用因素以及潛在的治療靶點。

1 方 法

1.1 前列腺癌組織芯片和組織標本獲取

從中國西安艾麗娜生物科技有限公司購買含有192 例組織標本的組織芯片（#PR1921c），其中包含160 例前列腺癌和16 例癌旁標本。從中山大學腫瘤醫(yī)院收集103 例從2000 年至2018 年的前列腺癌石蠟包埋的組織，所有組織都是經(jīng)根治性前列腺切除術或者經(jīng)尿道前列腺電切術獲取并經(jīng)兩位病理科醫(yī)師確認，患者組織的獲取和使用均與患者簽署知情同意書，并通過中山大學倫理委員會的審核通過。對患者隨訪的信息包括：年齡、Gleason 評分、腫瘤TNM 分期（按2014 年中國泌尿外科指南）、生存狀態(tài)等，嚴格保護患者信息和隱私。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）

結果計算：根據(jù)所獲得目標基因和內(nèi)參GAPDH 的熒光信號值達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CT 值），根據(jù)公式2-［（實驗組目的基因CT—實驗組內(nèi)參CT）-（對照組目的基因CT—對照組內(nèi)參CT）］計算相對表達量。

本研究所使用引物序列如表1 所示（試劑盒#RR820A，Takara）。

表1 本研究所使用引物序列

1.3 細胞小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染

實驗所使用小干擾RNA 序列（siRNA）均購買于中國蘇州泓迅公司。細胞密度在60%左右且貼壁良好，取2個1.5 mL離心管，A管加入5 μL siRNA（10 μmol/L）和95 μL 無血清培養(yǎng)基（optimen），B 管加入3 μL Lipofectamine RNAimax（13778150，Life Technologies，美國沃爾瑟姆）和97 μL optimen（31985-070，GIBCO）；兩者混合靜置；將上述液體加入六孔板中，每孔加入800 μL optimen，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 提取RNA，用qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染是否成功。（實驗所用siRNA 序列：Si-RAI14-1：GAUGCCGUUACGGAAACAUTT；Si-RAI14-2：CACAAGAGAACAUCCCAGUTT；）

1.4 細胞遷移和侵襲實驗

用無血清培養(yǎng)基潤濕遷移小室（8 μm，353097，F(xiàn)alcon，中國上海）的基底膜，并將其置于有600 μL的完全培養(yǎng)基的專用24 孔板（3535040，F(xiàn)alcon）中；根據(jù)計數(shù)結果吸取DU145 4 萬個細胞，PC3 6 萬個細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋成200 μL 加入遷移小室上；將培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，DU145培養(yǎng)24 h 觀察結果，PC3 培養(yǎng)48 h 后觀察結果；使用4%多聚甲醛固定30 min；染色后進行觀察計數(shù)

細胞侵襲實驗步驟同上，不同點在于需要用基質(zhì)膠（#354234，康寧，美國）包被遷移小室，步驟如下：將標準濃度8～11 mg/mL 的基質(zhì)膠置于冰上融化，將標準基質(zhì)膠加入預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋30 倍，將100 μL 稀釋后的基質(zhì)膠加入遷移小室里，將24 孔板放入37℃1 h。吸出培養(yǎng)板中殘余液體即完成包被。

1.5 共培養(yǎng)實驗

①處死八周齡裸鼠，取其肺及腿部長骨，碾磨至1 mm3大小；②使用24 孔板及相應小室，下層置入1 mL 已收集的碾磨好的肺、骨組織，上層置入20000 個用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的DU145，PC3 細胞及敲低RAI14 后的DU145 及PC3 細胞；③培養(yǎng)48 h后取出小室，棄去上層培養(yǎng)液，放入提前準備好的24 孔板中，24 孔板內(nèi)加入800 μL 多聚甲醛；④固定半小時后取出小室，放入提前準備好的24孔板中，24 孔板內(nèi)加入800 μL；0.1%結晶紫；⑤染色半小時后取出小室，室溫下風干后用顯微鏡觀察記錄。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印記（Western blot，WB）

配置SDS-PAGE 凝膠（#P0012A 碧云天）：按說明書配制適量濃度的分離膠8 mL 和濃縮膠3 mL，蛋白樣品電泳：將制膠玻璃板固定于電泳槽中，加入電泳液，開啟電泳裝置，待蛋白樣品到達玻璃板底部時終止電泳。電轉(zhuǎn)：，安裝電轉(zhuǎn)裝置，倒入電轉(zhuǎn)液，電轉(zhuǎn)1.5～2 h。用封閉液（P0023B，碧云天）封閉PVDF 膜1 h；用一抗4℃孵育過夜。二抗室溫慢速搖晃孵育1 h；接著用TBST 洗脫3 次，每次10 min。顯影：將發(fā)光液滴加到PVDF 膜上并置于曝光機內(nèi)進行曝光顯影。本實驗所用抗體如下：一抗為RAI14（Thermo Scientific 貨號PA5-57887，1∶500）二抗為山羊抗兔（cw0103s）或者山羊抗鼠（cw0102s，1∶10，000，康為世紀）

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS v.20.0（SPSS，Armonk，美國紐約）或GraphPad Prism 5.0（GraphPad，美國拉荷亞）軟件進行統(tǒng)計分析。資料描述時：定量資料數(shù)據(jù)采用三次獨立實驗數(shù)據(jù)的均值±標準差表示，定性資料用每種分類的例數(shù)標書。統(tǒng)計分析時：兩組獨立樣本間使用雙邊獨立樣本t檢驗；單因素多組定量資料使用單因素方差分析聯(lián)合Dunnett′s 兩兩比較的方法；兩因素的兩組或多組定量資料使用析因分析進行比較；定量資料使用卡方檢驗進行比較。RAI14 與患者之間的采用Kaplan-Meier 生存分析，并且使用log-rank 檢驗進行分析。P值小于0.05 認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 通過前期研究及生信分析發(fā)現(xiàn)RAI14 與前列腺癌的進展密切相關

通過對各臨床病理指標與前列腺癌組織中RAI14 的表達關系的探究，我們發(fā)現(xiàn)RAI14 在病理分期分級以及格里森評分較高的前列腺癌組織中表達明顯上升，而與年齡、臨床分期、人種等因素無明顯關聯(lián)，這提示我們RAI14 可能可以作為一個評判前列腺癌進展的優(yōu)秀標記物，并且在各年齡段及各人種均適用（見表2）。

表2 各臨床病理指標與前列腺癌組織中RAI14 的表達關系

我們對公共數(shù)據(jù)庫中前列腺癌原位癌與癌旁組織、前列腺癌原位癌與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶與癌旁組織的差異表達基因進行取交集（圖1），發(fā)現(xiàn)RAI14、ZC3H15、LAMC1、THBS2、HOXC6、POSTN、LUM、COL4A1、PLOD2、NAA15 等基因在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中表達量明顯上升。而通過對上述基因進行生信分析及文獻調(diào)研后，發(fā)現(xiàn)RAI14可能是調(diào)控的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的基因之一。

2.2 體外實驗證實RAI14 促進前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移

我們首先對RAI14 進行生存分析，發(fā)現(xiàn)低表達RAI14 的患者無病生存率更高（P=0.019）（圖2A），之后我們對前列腺癌細胞系PC3，DU145 進行了RAI14的本底表達測量，發(fā)現(xiàn)RAI14在PC3及DU145中均高表達（圖2B）。我們設計了5 個不同序列的小干擾RNA（siRNA）瞬時轉(zhuǎn)染DU145 和PC3 兩株前列腺癌細胞系。這些瞬轉(zhuǎn)的細胞株都會通過qPCR 和Western blot 的方法驗證敲低和過表達RAI14 的有效性，結果顯示在DU145 和PC3 細胞系中，RAI14 的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白水平明顯下調(diào)（圖2C）而我們最終選擇了效率更高的si-1 以及si-2 進行后續(xù)的實驗。隨后我們進行了相關的功能實驗。敲低RAI14 后的PC3，DU145 細胞系中進行遷移與侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，PC3，DU145 的遷移與侵襲能力均下降（P＜0.01）（圖2D，E）。隨后我們將PC3，DU145 與肺，肝，骨的細胞培養(yǎng)上清進行共培養(yǎng)，觀察不同組織對腫瘤細胞的趨化作用，我們發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，腫瘤細胞對上清的趨化作用明顯減弱（P＜0.01）（圖2F）。通過觀察常見的骨轉(zhuǎn)移灶-肝、肺、骨對前列腺癌腫瘤細胞的趨化作用，可以看出骨與肺對腫瘤細胞的趨化作用是明顯更強的，在此基礎上，我們進行了原代共培養(yǎng)，通過解剖小鼠，將其骨（Hfob1-19）與肺（Beas-2b）組織研磨至1 mm3大小置于下層，觀察其對腫瘤細胞的趨化作用，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，腫瘤細胞的趨化作用減弱，且對骨的趨化作用的減弱明顯多于對肺的趨化作用的減弱（見圖2）。

圖2 體外實驗證實RAI14 促進前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移

2.3 RAI14 可能通過激活AKT 通路發(fā)揮作用

通過體外功能實驗證實了RAI14 對腫瘤細胞骨轉(zhuǎn)移的促進功能后，我們進行了相關的文獻檢索，發(fā)現(xiàn)RA14 在其它癌癥中可能通過AKT 信號通路促進腫瘤進展。我們敲低RAI14 后進行了全轉(zhuǎn)錄組測序，通路富集分析顯示AKT 通路被過度激活，以及一些細胞外基質(zhì)相關通路被激活。差異基因表達分析顯示AKT 表達在敲低RAI14 后明顯改變。（圖3A、B）之后我們敲低RAI14 后進行WB實驗，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 后，AKT 通路確實發(fā)生了改變，主要體現(xiàn)在AKT 蛋白表達量改變不明顯，但是pAKT 的表達量明顯下降。說明RAI14 通過促進AKT 的磷酸化導致AKT 通路的激活，進而發(fā)揮作用并調(diào)控前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。（圖3C）通過繪制ROC 曲線，可以發(fā)現(xiàn)以RAI14 作為前列腺癌的生物標記物的AUC 值大于0.5，對于預測及評估前列腺癌的進展有一定的價值。

圖3 RAI14 可能通過激活AKT 通路發(fā)揮作用

圖4 ROC 曲線顯示，以RAI14 作為前列腺癌的生物標記物的AUC 值大于0.5，對于預測及評估前列腺癌的進展有一定的價值

3 結 論

RAI14（維甲酸誘導基因14）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與RAI14 相關的疾病包括心肌病、嬰兒組織細胞瘤和雙胎輸血綜合征。既往研究顯示在胞質(zhì)特化（睪丸特有的一種細胞連接）的肌動蛋白調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。對建立精子極性和正常精子細胞粘附很重要。還可以促進血睪丸屏障處支持細胞緊密連接的完整性。RAI14 在體內(nèi)主要通過影響細胞連接、黏附等功能來維持作用。在其他癌種研究中，有報道RAI14 可能通過AKT 通路影響腫瘤進展并推進骨轉(zhuǎn)移的進程。AKT 通路在前列腺癌中過度激活可促進腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，誘導腫瘤耐藥［15-17］。統(tǒng)計顯示，42%的局限性前列腺癌患者存在AKT 信號通路改變，并且所有轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中均可檢測到AKT 通路有不同程度的激活［18-19］。我們敲低RAI14 后進行功能實驗及WB實驗，發(fā)現(xiàn)敲低RAI14 導致腫瘤轉(zhuǎn)移能力降低，并且AKT 通路被過度激活。

我們通過對臨床數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)RAI14 在病理分期分級以及格里森評分較高的前列腺癌組織中表達明顯上升，而與年齡、臨床分期、人種等因素無明顯關聯(lián)，之后通過前列腺癌數(shù)據(jù)庫的篩選，找出了與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移進程密切相關的RAI14。并且生信分析證明RAI14 與前列腺癌進展密切相關。我們的體外功能實驗證實了RAI14調(diào)控前列腺癌腫瘤細胞的遷移侵襲能力，并且共培養(yǎng)實驗結果提示我們RAI14 不僅影響著遷移侵襲，還對不同的組織有不同的趨化趨勢，最后我們通過WB 實驗初步探究了RAI14 的下游通路，發(fā)現(xiàn)下游的AKT 通路的磷酸化水平明顯上升，結合文獻調(diào)研中其他癌種的研究，我們考慮這可能是導致前列腺癌進一步的進展，推動骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生的重要途徑。我們未來的工作將致力于繼續(xù)探討并驗證RAI14 作用在AKT 的具體磷酸化位點以及構建相應的小鼠骨轉(zhuǎn)移模型，并完善體內(nèi)實驗。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAI14 可能通過磷酸化激活AKT 通路調(diào)控前列腺癌腫瘤細胞的遷移與侵襲能力，進而推動骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。并且RAI14 本身有成為一個前列腺癌生物標記物的潛能。