雷蓉，李珣，賀詩(shī)施，聶燕

膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，其中惡性程度最高的為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHO IV），其發(fā)病率約為3/1 000 000［1］。在經(jīng)過(guò)手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)治療后，其中位生存時(shí)間仍不到1 年［2］，聯(lián)合替莫唑胺化療中位無(wú)進(jìn)展生存期為4.0個(gè)月，中位總生存期為16個(gè)月，在維持替莫唑胺化療中的基礎(chǔ)上加入腫瘤治療電場(chǎng)（TTFields）治療后可改善預(yù)后，其中位無(wú)進(jìn)展生存期比單獨(dú)使用替莫唑胺提高2.7 個(gè)月，中位總生存期提高4.9 個(gè)月［3］。這些數(shù)據(jù)表明腦膠質(zhì)瘤預(yù)后不良，嚴(yán)重威脅患者生命，迫切需要新的治療方法。

TEAD2 是TEAD（transcriptional enhanced associate domain，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是HIPPO 信號(hào)通路的主要轉(zhuǎn)錄因子，其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4］。TEAD2通過(guò)調(diào)控PAX3的表達(dá)調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化，同時(shí)，TEAD2 在神經(jīng)元增殖過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用［5］。在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，TEAD2與E2A 結(jié)合抑制乙酰輔酶A 合成以促進(jìn)腫瘤發(fā)生［6］；與YAP 結(jié)合促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［7］。因此，考慮到TEAD2在神經(jīng)系統(tǒng)和在腫瘤中的作用，我們推測(cè)TEAD2可能促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。為揭示其在膠質(zhì)瘤中的作用，我們通過(guò)生物信息學(xué)，挖掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)，探討了TEAD2表達(dá)模式及臨床病理意義，為進(jìn)一步研究TEAD2在膠質(zhì)瘤的作用提供新的思路和理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)處理

泛癌中基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于Timer2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//timer.comp-genomics.org/）、UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//xenabrowser.net/），每個(gè)腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)數(shù)據(jù)從CCLE 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portals.broadinstitute.org/）下載。并收集了CGGA 和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）和GBM 樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。CGGA 樣本包括mRNAseq_325、mRNAseq_693 和scRNA-seq 數(shù) 據(jù) 集［8，9］。本 研 究中CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中患者的臨床和隨訪信息均可在CGGA 網(wǎng)站（http：//www.cgga.org.cn/）上獲得。此外，驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床和隨訪數(shù)據(jù)從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcga-data.nci.nih.gov/）下載。

1.2 TEAD2 在泛癌組織中的表達(dá)分析

利用R 包EdgeR 分析腫瘤組織與正常組織中TEAD2表達(dá)水平的差異。采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析TEAD2的表達(dá)水平。由R包ggplot繪制小提琴圖。

1.3 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析

利用R 包Dplyr、Seurat、Patchwork 進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析。利用GBM 單細(xì)胞網(wǎng)站（https：//singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP393/single-cell-rna-seq-of-adult-and-pediatric-glioblastoma）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 分析TEAD2 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的臨床病理特征的相關(guān)性

利用R 包Pheatmap 繪制TEAD2 與膠質(zhì)瘤分子、臨床特征的熱圖。利用R 包ggplot2 繪制箱線圖。

1.5 分析TEAD2 對(duì)膠質(zhì)瘤生存、預(yù)后的影響

使用Kaplan-Meier 進(jìn)行生存分析，使用COX 回歸進(jìn)行預(yù)后因素篩選。

1.6 功能富集分析

TEAD2 相關(guān)的基因，或細(xì)胞集群的特征基因列表，上傳到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），獲得基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科路徑（KEGG）分析富集結(jié)果。

1.7 CCK8 實(shí)驗(yàn)

將膠質(zhì)瘤細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔，24 h 后將培養(yǎng)基替換為含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h 后加入含10 μL CCK8 的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 度孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光值

1.8 細(xì)胞周期測(cè)定

將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種至6 孔板，貼壁后加入含有不同濃度的藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h 后，用胰酶消化細(xì)胞至15 mL 離心管中，用1000 r/min 離心5 min，棄掉培養(yǎng)基。加入2 mL PBS 重懸細(xì)胞，用1000 r/min 離心5 min，棄上清，留沉淀，用0.2 mL PBS 重懸細(xì)胞，加入提前配置好的2 mL 70%冰乙醇固定細(xì)胞，混勻后，封口于4 ℃過(guò)夜；將固定過(guò)夜的細(xì)胞懸液用1000 r/min 離心5 min，棄上清，留沉淀，加入2 mL PBS，混勻后用1000 r/min 離心5 min，棄上清。加入50 μL RNA 酶，450 μL PI 染色液，4 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 TEAD2 在膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中高表達(dá)

為確定TEAD2 在泛癌中的mRNA 表達(dá)譜，分析了Timer 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中TEAD2 在各種腫瘤組織中的表達(dá)情況。對(duì)腫瘤組織與正常組織中TEAD2 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其在膠質(zhì)瘤（GBM）、乳腺浸潤(rùn)癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)（圖1A）。鑒于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常組織樣本量較少，于是結(jié)合GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了34 種腫瘤中正常樣本和腫瘤樣本的TEAD2 mRNA 表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在GBM等14種腫瘤組織中TEAD2表達(dá)富集（圖1B）。進(jìn)一步，利用從CCLE 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的單個(gè)腫瘤細(xì)胞系數(shù)據(jù)，根據(jù)組織來(lái)源分析32 個(gè)細(xì)胞系中TEAD2的表達(dá)水平（圖1C）。從泛癌組織中TEAD2的表達(dá)分析可以發(fā)現(xiàn)，TEAD2 在多種腫瘤組織中的表達(dá)水平普遍高于正常組織。

圖1 TEAD2 在泛癌中的表達(dá)

2.2 TEAD2 主要在膠質(zhì)瘤的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)

為闡明TEAD2 在膠質(zhì)瘤中的作用，我們進(jìn)一步從單細(xì)胞維度分析了TEAD2 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。從CGGA 數(shù)據(jù)中下載了14 名患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定出4 個(gè)細(xì)胞群分別為腫瘤細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其中，TEAD2的表達(dá)主要富集在腫瘤細(xì)胞中（圖2A、B）。通過(guò)GBM 單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)，驗(yàn)證了在膠質(zhì)瘤中，TEAD2主要在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)（圖2C、D）。

圖2 TEAD2 的表達(dá)模式

2.3 TEAD2 表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤惡性程度增高而升高

不同TEAD2 表達(dá)水平的患者表現(xiàn)出不同的臨床和病理特征。TEAD2、MGMT 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、1p/19q 共缺失狀態(tài)、IDH 突變狀態(tài)、WHO 分級(jí)和組織學(xué)診斷的增加在CGGA 和TCGA 數(shù)據(jù)集中呈不對(duì)稱分布（圖3A～C）。對(duì)這些樣本進(jìn)行分組比較分析。在CGGA 325 數(shù)據(jù)庫(kù)中，TEAD2 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤、無(wú)1p/19q 共缺失的樣本和IDH-野生型膠質(zhì)瘤中高度富集（圖3D～K）。該結(jié)果在CGGA693 數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到證實(shí)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MGMT 啟動(dòng)子未甲基化的樣本中TEAD2高表達(dá)（圖3L～O）。以上結(jié)果表明：惡性程度較高的膠質(zhì)瘤中，TEAD2 表達(dá)水平更高。

圖3 TEAD2 表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的相關(guān)性

2.4 TEAD2 高表達(dá)的患者預(yù)后更差

在膠質(zhì)瘤患者中的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，我們基于CGGA 和TCGA 數(shù) 據(jù) 庫(kù)進(jìn)行Kaplan- Meier 和Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。在CGGA 325 數(shù)據(jù)庫(kù)，高表達(dá)TEAD2 的患者預(yù)后更差，總生存期更短。在CGGA639 數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，該結(jié)論表現(xiàn)一致（圖4A～C）。在Cox 回歸分析中，CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)表明TEAD2 表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立于已知預(yù)后因素的預(yù)后因素，包括WHO 分級(jí)、診斷時(shí)年齡、IDH 突變、1p/19q 共缺失、MGMT 啟動(dòng)子甲基化、腫瘤復(fù)發(fā)狀態(tài)和放化療狀態(tài)（表1、表2）。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)由于缺乏部分臨床數(shù)據(jù)，暫不能表明TEAD2 作為獨(dú)立預(yù)后因素（表3）。這些發(fā)現(xiàn)表明TEAD2 在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中是膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。

表1 CAGG325 數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者總生存的COX 回歸分析

表2 CAGG693 數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者總生存的COX 回歸分析

表3 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者總生存的COX 回歸分析

圖4 TEAD2 表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

同時(shí)，分析了TEAD2 是否可以作為膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)，曲線下面積（AUC）在CGGA 325 數(shù)據(jù)庫(kù)中達(dá)73.2%，在CGGA 693數(shù)據(jù)庫(kù)中，AUC為52.6%，但在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中AUC 為78.6%（圖4E）。因此，TEAD2 可能是膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)。

2.5 TEAD2 在膠質(zhì)瘤中參與細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程

為了探究TEAD2相關(guān)的生物學(xué)功能，在CGGA和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)Pearson 相關(guān)分析（|R|＞0.5，P＜0.05）篩選出與TEAD2 相關(guān)基因，并進(jìn)行GO和KEGG 分析。在CGGA 325 數(shù)據(jù)庫(kù)中，與TEAD2最相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞分裂、DNA 復(fù)制、有絲分裂等生物學(xué)過(guò)程（圖5A）；最相關(guān)的細(xì)胞成分是細(xì)胞核（圖5B）；最相關(guān)的分子功能為蛋白、RNA 和DNA 結(jié)合（圖5C）；最相關(guān)的信號(hào)通路是DNA 復(fù)制信號(hào)通路（圖5J）。在CGGA693 和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，與TEAD2 相關(guān)的生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能和信號(hào)通路與CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)相似（圖5）。這些發(fā)現(xiàn)表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的TEAD2與細(xì)胞周期密切相關(guān)，可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期過(guò)程。

圖5 TEAD2 與膠質(zhì)瘤中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān)

2.6 靶向TEAD2 是有效治療腦膠質(zhì)瘤的策略

為尋找靶向TEAD2 的藥物，我們檢索了小分子抑制劑庫(kù)，發(fā)現(xiàn)氟芬那酸（flufenamic acid）可以與TEAD2YBD 的中央囊袋結(jié)合，進(jìn)而抑制TEAD2功能。于是，我們?cè)谌四z質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 和U87中，通過(guò)CCK8 實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，在50μM 和100μM 的藥物濃度下，檢測(cè)氟芬那酸對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響。CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氟芬那酸可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中U251 細(xì)胞系更為敏感，在72 h 時(shí)出現(xiàn)顯著差異（圖6A、B）。流式細(xì)胞術(shù)PI 染色結(jié)果表明：氟芬那酸可以使U251 和U87 細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期（圖6 C、D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟芬那酸可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖7）。因此，靶向TEAD2 可能是有效的腦膠質(zhì)瘤治療策略。

圖6 氟芬那酸對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和周期的影響

圖7 氟芬那酸作用于TEAD2 YBD 引起細(xì)胞周期阻滯抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)模式圖

3 討 論

雖然腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率低，但其為最難治療的腫瘤之一，中位生存時(shí)間不超過(guò)兩年［10］，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，威脅患者生命。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變，染色體1p/19q 共缺失，H3 Lys27甲基化等分子生物學(xué)特征可能有助于腦腫瘤的診斷、分級(jí)和治療，為膠質(zhì)瘤的治療提供了新方向［11］。但由于存在獨(dú)特的解剖學(xué)因素和腫瘤免疫微環(huán)境，表明新療法的開(kāi)發(fā)仍具有重大挑戰(zhàn)。于是，進(jìn)一步挖掘生物分子靶點(diǎn)，對(duì)探索膠質(zhì)瘤的治療具有重要的意義。

TEAD 轉(zhuǎn)錄因子與共激活劑YAP/TAZ 形成異源二聚體，激活Hippo 信號(hào)通路相關(guān)下游基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡［12］。TEAD2 在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)豐富，直接結(jié)合Pax3 表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育，TEAD2 亦可調(diào)節(jié)Foxa2 在脊索發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，這些結(jié)果證實(shí)了其在神經(jīng)發(fā)育中的作用［5］。在腫瘤研究中，TEAD2 驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)基底樣胰腺癌細(xì)胞中重編程增強(qiáng)子景觀和轉(zhuǎn)移［13］；在結(jié)直腸癌中，其極易發(fā)生突變，具有高度的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性［14］；在Her2 陽(yáng)性乳腺癌中，其誘導(dǎo)對(duì)曲妥珠單抗耐藥［15］。因此，靶向TEAD2 是潛在的腫瘤治療策略。但目前為止，尚未有直接靶向TEAD2 的特異性藥物，Ajaybabu V. Pobbati 等人通過(guò)X 射線晶體學(xué)篩選Pharmakon 文庫(kù)發(fā)現(xiàn)氟芬那酸可以與TEAD2 YBD 結(jié)合，經(jīng)氟芬那酸處理后的HEK293 細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力和遷移能力均顯著降低，Rajesh Pal 等人［16］進(jìn)一步尋找TEAD2的靶向藥物，并篩選到2 個(gè)化合物：一種熔融吡唑衍生物ZINC95969481（LG1），一種芴衍生物ZINC05203789（LG2），該化合物與TEAD2 的結(jié)合能力均顯著強(qiáng)于氟芬那酸，但進(jìn)一步應(yīng)用仍需要探索。綜上，靶向TEAD2 是腫瘤的潛在治療策略。

本研究基于CGGA 和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者的mRNA- seq 數(shù)據(jù)，分析了TEAD2 在不同病理類型膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，研究結(jié)果表明TEAD2 在惡性膠質(zhì)瘤亞型中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)。單細(xì)胞分析結(jié)果表明TEAD2 特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中。進(jìn)一步通過(guò)GO 和KEGG 功能富集，發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、DNA 復(fù)制等生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)使用靶向TEAD2 YBD 中央囊袋的藥物氟芬那酸處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以抑制其增殖，引起細(xì)胞周期阻滯。這些結(jié)果表明，TEAD2 可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，影響著腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，TEAD2 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義，可以作為膠質(zhì)瘤潛在的治療和診斷靶點(diǎn)。