歐子維，王博，鐘文龍，黃健*

PD-1/PD-L1 阻斷療法是膀胱癌免疫治療的重要組成部分，用于不適合鉑類化療或化療無效的晚期轉移性膀胱癌［1］。然而，針對PD-1/PD-L1 的免疫檢查點抑制劑的客觀反應率較低［2，3］，因此亟需找到新的免疫治療靶點。

T 細胞激活抑制物免疫球蛋白可變區(qū)結構域（V-domain immunoglobulin suppressor of T-cell activation，VISTA），是一種新發(fā)現(xiàn)的負性免疫檢查點，與PD-1/PD-L1 同屬于B7 家族［4，5］。VISTA 主要由免疫細胞表達［6-8］，過去多項研究報道，VISTA 可以抑制CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞等免疫細胞的激活［6，9，10］。除此之外，有研究稱在結腸癌里VISTA 阻斷可以增強PD-L1 阻斷抗體的抗腫瘤效果［11］，阻斷VISTA 和阻斷PD-1 所引起的通路變化是非冗余的［12］。然而目前膀胱癌中VISTA 和免疫微環(huán)境的關系，以及VISTA 和PD-1/PD-L1 軸的關系尚不明確。

本研究結合TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)庫和我院膀胱癌隊列，首先比較了VISTA和其他免疫檢查點的表達水平，鑒定了高表達VISTA 腫瘤的差異通路、差異基因、免疫浸潤情況，以及與一些免疫檢查點的相關性。后根據(jù)VISTA 和PD-1/PD-L1 表達水平鑒定了新的免疫亞型，并鑒定了同時高表達VISTA和PD-1/PD-L1 腫瘤的差異基因、免疫浸潤情況以及臨床相關性。最后建立了小鼠的皮下膀胱癌模型，測試了聯(lián)合阻斷VISTA與PD-1的抗腫瘤效力。

1 資料與方法

1.1 臨床資料和數(shù)據(jù)庫資料的收集

本研究所使用的52 例膀胱癌組織均收集自在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院泌尿外科經病理診斷為膀胱癌（尿路上皮癌）并接受治療的膀胱癌患者。本實驗遵循赫爾辛基宣言，并且已獲得中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準（倫理號：SYSKY-2023-244-01）。本研究已獲得患者的知情同意。組織經固定、包埋后切成4 μm 厚度的組織切片，進行后續(xù)的免疫組化和免疫熒光染色。TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集下載自https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/。

1.2 差異基因分析

TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集共有414 例膀胱癌測序數(shù)據(jù)。以中位值作為cut-off值，根據(jù)VSIR（VISTA編碼基因）的表達水平分為VISTAlow和VISTAhigh組，利用“DESeq”R 包做差異分析，篩選VISTAhigh組對比VISTAlow組的差異基因。以中位值作為cut-off值，根據(jù)VISTA 和PD-L1 表達水平分為4 組：VISTAlow-PD-L1low，VISTAhighPD-L1low，VISTAlowPD-L1high和VISTAhighPD-L1high，利用“l(fā)imma”R 包做多組差異分析，分別篩選VISTAhighPD-L1high組對比VISTAlowPD-L1low組、VISTAhighPD-L1low組、VISTAlowPD-L1high組的差異基因。以中位值作為cut-off值，根據(jù)VISTA和PD-1表達水平分為4 組：VISTAlowPD-1low，VISTAhighPD-1low，VISTAlowPD-1high和VISTAhighPD-1high，利用“l(fā)imma”R包做多組差異分析，分別篩選VISTAhighPD-1high組對比VISTAlowPD-1low組、VISTAhighPD-1low組、VISTAlow-PD-1high組的差異基因。差異基因的篩選條件為log2FDR≥1 以及adjustP＜0.05。差異基因的可視化使用“pheatmap”R 包實現(xiàn)。

1.3 GO 通路富集分析

利用“ClusterProfiler”R 包對前述差異基因進行GO（Gene Ontology）通路富集分析，篩選標準為adjustP＜0.05。這些通路分為生物過程（Biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），本文僅展現(xiàn)BP。

1.4 免疫浸潤分析

利用“cibersort”R 包進行免疫浸潤分析。Cibersort 浸潤分析使用的22 種免疫細胞基因集來自R 包內置的LM22 基因集。利用“pheatmap”R 包和“ggplot2”R 包實現(xiàn)免疫浸潤的可視化。

1.5 臨床相關性分析

利用我院膀胱癌隊列，如前述根據(jù)VISTA 和PD-1 或PD-L1 表達量分為4 組后，分析比較這4 組與病人的臨床病理特征的相關性。

1.6 免疫組化與多色免疫熒光

免疫組化：將蠟塊組織切成4 μm 厚度的組織切片，脫蠟后用1%H2O2除去內源性過氧化物酶，使用Tris-EDTA 進行抗原修復，使用正常馬血清封閉非特異性結合位點后，4 ℃搖床孵育一抗過夜，第二天37 ℃孵育對應二抗，然后進行DAB 染色和蘇木素染色。一抗信息如下：人VISTA（1∶400，Cell signaling technology，USA），人CD8（1∶500，Thermofisher，人PD-L1（1∶200，Abcam，USA），人PD-1（1∶200，Cell signaling technology，USA）。光學顯微鏡采集3～5 個×400 高倍鏡視野后計數(shù)，以此評估VISTA 和CD8 的表達。PD-L1 和PD-1 評價方法見本課題組前期研究［13］。

多色免疫熒光：步驟與免疫組化類似，孵育二抗后，孵育熒光染液。之后循環(huán)進行抗原修復、封閉，孵育一抗、二抗、熒光染液。最后，使用DAPI使細胞核著色。一抗信息如下：人VISTA（1∶3000，Cell signaling technology，USA），人CD204（1∶3000，R&D system，USA），人CD8（1∶3000，Thermofisher，USA），人TIM3（1∶1000，Cell signaling technology，USA），人LAG3（1：1000，Cell signaling technology，USA），人IDO1（1：3000，Cell signaling technology，USA）。

1.7 動物實驗

本研究使用的C57 雌鼠（周齡4～5 w）購自廣東斯嘉景達生物科技有限公司，飼養(yǎng)于華南理工大學的SPF（specific pathogen-free）級屏障設施。所有實驗均獲得華南理工大學倫理委員會批準（倫理號：2023018）。待移形上皮癌細胞系Mb49增殖到一定程度，將其消化、計數(shù)，注射于小鼠右側背部（5×105/只），從第3 天開始，每3 天腹腔給予200 μg 的VISTA 阻斷抗體和/或PD-1 阻斷抗體，共給5 次藥，第20 天脫頸處死小鼠。用游標卡尺檢測腫瘤生長，每天量一次，腫瘤體積的計算公式為：L×W2，L 為長，W 為寬。

1.8 統(tǒng)計分析

免疫檢查點mRNA 表達量的比較采用Wilcoxon 秩和檢驗?；蛳嚓P性分析采用Spearman 相關性檢驗。VISTA 組化表達量和腫瘤生長曲線的比較采用非配對t檢驗。臨床相關性分析采用耶茨的連續(xù)性修正檢驗（Yates′s correction for continuity）。突變瀑布圖采用卡方檢驗。檢驗水準雙側α=0.05，*為P＜0.05，**為P＜0.01，***為P＜0.001。

2 結 果

2.1 VISTA 在膀胱癌中高表達且與免疫抑制微環(huán)境相關

為了提高免疫治療療效，尋找新的潛在的免疫治療靶點，我們對負性免疫檢查點進行了篩選。我們下載了TCGA 的414 例膀胱癌的測序數(shù)據(jù)，并比較了幾種常見的負性免疫檢查點的表達水平。這些負性免疫檢查點基因包括了VSIR，PDCD1，LAG3，HAVCR2，CD274，CTLA4，IDO1，SIGLEC15，分別編碼VISTA，PD-1，LAG3，TIM3，PDL1，CTLA4，IDO1，SIGLEC15 蛋白。我們發(fā)現(xiàn)，在這些負性免疫檢查點之中，VSIR 的表達水平最高（圖1A），于是我們聚焦于VISTA 進行后續(xù)研究。VISTA 是一種負性免疫檢查點，在多癌種被證實與腫瘤免疫抑制狀態(tài)相關。

為了探究VISTA 對膀胱癌免疫微環(huán)境的影響，在TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集中，我們根據(jù)VISTA 的表達量，以中位值作為cut-off 值，分為VISTAlow 和VISTAhigh 兩組，進行差異分析后進行了GO 通路富集了分析。我們發(fā)現(xiàn)，VISTA 高表達與免疫抑制通路相關，如免疫系統(tǒng)負調節(jié)（negative regulation of immune system process）、淋巴細胞激活負調節(jié)（negative regulation of lymphocyte activation）等通路（圖1B）。差異基因火山圖顯示，VISTAhigh 組上調了一系列免疫抑制基因，這些基因包括CD163、MRC1、IDO1、LAG3、HAVCR2、CSF1R、PDCD1 等（圖1C）。

接著我們又利用“cibersort”算法進行了免疫浸潤分析。Cibersort 結果顯示，與VISTAlow組相比，VISTAhigh組Tfh 細胞以及漿細胞浸潤減少，而M2 型巨噬細胞等細胞浸潤增多（圖1D）?；蛳嚓P性分析顯示VISTA 與CD8A 以及CD204 正相關（圖1E和1F）。同樣地，利用我院膀胱癌組織樣本進行多色免疫熒光染色，也發(fā)現(xiàn)VISTA+細胞的浸潤程度與CD204+巨噬細胞（M2 型巨噬細胞）、CD8+T 細胞的浸潤程度有著共同分布的關系（圖1G），提示VISTA通路與這些免疫細胞存在相互作用。

我們還探究了VISTA 與一些抑炎性細胞因子的相關性。相關性熱圖顯示，VISTA 與TGFB1、TGFB2、TGFB3、IL10、IL33、CSF2 呈正相關，而與IL4、TSLP 以及IL25 沒有相關性（圖1H）。

這些結果提示膀胱癌中VISTA 高表達且與免疫抑制微環(huán)境相關。

2.2 膀胱癌中VISTA 的表達水平與多種負性免疫檢查點相關

差異分析火山圖顯示IDO1、LAG3、PDCD1 等免疫檢查點表達上調，于是我們進一步分析了VISTA 與幾種常見免疫檢查點的相關性，結果顯示：VSIR 與PDCD1，CD274，LAG3，HAVCR2，CTLA4，IDO1 的表達呈正相關，而與SIGLEC15 的表達呈負相關（圖2A）。為了進一步驗證這種相關性，利用我院膀胱癌組織樣本，我們進行了多色免疫熒光染色，同樣發(fā)現(xiàn)，VISTA+細胞浸潤多的地方，IDO1、LAG3，TIM3 的表達也多（圖2B）。另外，通過組化染色也發(fā)現(xiàn)，VISTA 與PD-L1 以及PD-1具有正相關的分布特點（圖2C～F）。

圖2 膀胱癌中VISTA 的表達水平與多種負性免疫檢查點相關

這些結果提示膀胱癌中VISTA 的表達水平與多種負性免疫檢查點相關。

2.3 根據(jù)膀胱癌中VISTA 和PD-1/PD-L1 表達水平鑒定新的免疫亞型

目前，抗PD-1/PD-L1抗體是臨床上唯一應用于膀胱癌的免疫檢查點抑制劑，然而其客觀反應率不高［2］。前面我們發(fā)現(xiàn)了VISTA 的表達水平比PD-1/PD-L1 高，且VISTA 表達量與PD-1/PD-L1 呈正相關，于是，為了進一步探究VISTA 與PD-1/PD-L1 的關系，我們利用TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)集，根據(jù)VISTA和PD-1/PD-L1 表達水平鑒定新的免疫亞型。以中位值作為cut-off 值，根據(jù)VISTA 和PD-L1 表達水平鑒定了4種免疫亞型：VISTAlowPD-L1low，VISTAhighPDL1low，VISTAlowPD-L1high和VISTAhighPD-L1high。根據(jù)這個分組，我們利用cibersort 算法進行了免疫浸潤分析，發(fā)現(xiàn)與其他3組相比，VISTAhighPD-L1high組明顯富集M1型巨噬細胞，CD8+T細胞，激活的CD4+T細胞，而低富集激活的NK 細胞（圖3A）。除此之外，我們利用“l(fā)imma”R 包進行多組差異分析并繪制了火山圖。與VISTAlowPD-L1low相比，VISTAhighPD-L1high上調了IDO1、PDCD1、MRC1、HAVCR2、TIGIT、FOXP3、LAG3、TGFB1、TGFB2、TGFB3（圖3C）。與VISTAhigh-PD-L1low相 比，VISTAhighPD-L1high上 調 了IDO1、PDCD1、MRC1、HAVCR2、FOXP3、LAG3、TGFB2、TIGIT、CCL18、CD163（圖3D）。與VISTAlowPD-L1high相比，VISTAhighPD-L1high上調了IDO1、PDCD1、MRC1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CCL18、CD163（圖3E）。

同樣以中位值作為cut-off 值，根據(jù)VISTA 和PD-L1 表達水平也鑒定了4 種免疫亞型：VISTAlow-PD-1low，VISTAhighPD-1low，VISTAlowPD-1high，和VISTAhigh-PD-1high。免疫浸潤分析發(fā)現(xiàn)VISTAhighPD-1high組明顯富集M1 型巨噬細胞，CD8+T 細胞，激活的CD4+T細胞，而低富集單核細胞（圖3B）。多組差異分析火山圖顯示，與VISTAlowPD-1low相比，VISTAhighPD-1high上 調 了IDO1、CD163、CCL18、CTLA4、LAG3、MRC1、TIGIT、HAVCR2、FOXP3、CD274、TGFB1、TGFB2、TGFB3（圖3F）。與VISTAhighPD-1low相比，VISTAhighPD-1high上調了IDO1、CD163、CCL18、CTLA4、LAG3、MRC1、TIGIT、HAVCR2、FOXP3、CD274、TGFB2、TGFB3（圖3G）。與VISTAlowPD-1high相比，VISTAhighPD-1high上調了IDO1、CD163、MRC1（圖3H）。

這些結果提示膀胱癌中VISTA 和PD-1/PD-L1同時高表達與更加抑制的免疫微環(huán)境相關。

2.4 膀胱癌中VISTA 與PD-1/PD-L1 的表達和進展型膀胱癌相關

前面我們根據(jù)TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)庫中VISTA和PD-1/PD-L1表達水平鑒定了新的免疫亞型，比較了各亞型的免疫浸潤情況并進行了多組間的差異基因分析，緊接著我們又利用我院的膀胱癌隊列，根據(jù)免疫細胞上VISTA 和PD-1/PD-L1 表達水平鑒定了新免疫亞型，并分析了這些免疫亞型與病人的臨床病理特征的關系。我們發(fā)現(xiàn)，同時高表達VISTA 和PD-1/PD-L1 與更高的T 分期、組織學分級以及CD8+T 細胞浸潤數(shù)量相關，而同時高表達VISTA和PD-L1還與更高的年齡相關（表1和表2）。

表1 我院膀胱癌隊列VISTA 與PD-L1 表達量與病人臨床病理特征的相關性 ［n（%）］

表2 我院膀胱癌隊列VISTA 與PD-1 表達量與病人臨床病理特征的相關性 ［n（%）］

這些結果提示免疫細胞上同時高表達VISTA與PD-1/PD-L1 與進展型膀胱癌相關。

2.5 Mb49 荷瘤小鼠模型中VISTA 阻斷抗體聯(lián)合PD-1 阻斷抗體能夠協(xié)同抑制腫瘤生長

鑒于VISTA 以及PD-1/PD-L1 與免疫浸潤以及腫瘤進展的相關，我們進一步在Mb49 荷瘤小鼠模型中測試了VISTA 阻斷抗體和PD-1 阻斷抗體的抗腫瘤作用（圖4A）。我們發(fā)現(xiàn)，單獨給予VISTA阻斷抗體無法抑制腫瘤生長，而單獨給予PD-1 阻斷抗體雖然能一定程度減緩腫瘤生長，但沒有統(tǒng)計學意義。值得注意的是，抗VISTA 抗體聯(lián)合PD-1阻斷抗體顯示出更加強大的抗腫瘤作用（圖4B）。這說明Mb49 荷瘤小鼠模型中VISTA 阻斷抗體聯(lián)合PD-1 阻斷抗體能夠協(xié)同抑制腫瘤生長。

圖4 Mb49 荷瘤小鼠模型中VISTA 阻斷抗體聯(lián)合PD1 阻斷抗體能夠協(xié)同抑制腫瘤生長

2.6 膀胱癌中VISTA 的表達水平與高頻基因突變負相關

我們還比較了TCGA 數(shù)據(jù)庫中VISTAlow 和VISTAhigh 這2 組間的一些膀胱癌相關癌基因的突變情況（圖5）。我們發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中TP53 和TTN 的突變頻率最高（n=392），分別有49.4%和47.3%的膀胱癌患者含有這2 種突變，然而其突變頻率在2 組間并無差異。分別有27.2%和14.1%的膀胱癌患者存在KDM6A 和FGFR3 的突變，這2 種基因的突變頻率均在2 組間呈現(xiàn)出顯著差異，VISTA 表達低的組里KDM6A 和FGFR3 的突變頻率較高。

圖5 VISTA 在膀胱癌中與高頻癌基因突變負相關

3 討 論

PD-1/PD-L1 阻斷抗體的臨床應用是膀胱癌免疫治療的一個里程碑，然而其客觀應答率不高［2］，提示我們需要尋找新的治療靶點。VISTA 是B7 家族的新成員［4］，目前膀胱癌中VISTA 對免疫微環(huán)境的影響，以及VISTA 和PD-1/PD-L1 軸的關系尚不明確。本研究結合TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)庫以及我院膀胱癌隊列，發(fā)現(xiàn)VISTA 與免疫抑制微環(huán)境相關，而同時高表達VISTA 和PD-1/PD-L1 呈現(xiàn)出獨特的免疫抑制性微環(huán)境，并與腫瘤惡性程度正相關，而且在小鼠皮下膀胱癌模型中聯(lián)合應用VISTA 和PD-1 阻斷抗體顯示出更強大的抗腫瘤效力，這些結果為新的膀胱癌免疫治療聯(lián)合方案提供了新思路和理論支持。

多項研究表明腫瘤中VISTA 能夠調節(jié)免疫微環(huán)境［4，14］。本研究發(fā)現(xiàn)VISTA 在膀胱癌中高表達，且與負性免疫通路、抑炎性細胞因子相關，與M2型巨噬細胞、CD8+T 細胞相關，提示VISTA 通路能夠作用于這些免疫細胞。同樣地，有研究報道，肺癌和淋巴瘤中VISTA 表達與腫瘤CD8+T 細胞正相關［15，16］，而且阻斷VISTA 能夠增加結直腸癌和黑色素瘤中CD8+T 細胞的浸潤，促進CD8+T 細胞激活［17，18］。這些結果都提示VISTA 與負性免疫微環(huán)境相關。

VISTA 與PD-1/PD-L1 都為B7 家族的成員，且VISTA 和PD-L1 的結構最為相似［4］。本研究發(fā)現(xiàn)VISTA 的表達與PD-1/PD-L1 正相關。過去有卵巢癌、肺癌和胃癌的研究同樣報道VISTA 與PD-1/PD-L1 的表達正相關［15，16，19，20］。另外，本研究發(fā)現(xiàn)同時高表達VISTA 和PD-1/PD-L1 與進展型的腫瘤特征相關，且聯(lián)合阻斷VISTA 和PD-1 能夠顯著延緩小鼠皮下腫瘤的生長。同樣地，結腸癌中聯(lián)用VISTA 和PD-L1 阻斷抗體顯示更加強大的抗腫瘤能力［11］。這些結果提示同時靶向VISTA 和PD-1/PD-L1 軸是一種潛在的新的免疫治療聯(lián)合方案。

除了VISTA 阻斷劑聯(lián)合PD-1/PD-L1 阻斷劑，VISTA 阻斷劑聯(lián)合先天免疫激動劑也是一種有前景的聯(lián)合治療方案。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）通路是先天免疫通路的重要組成部分［21，22］。VISTA 曾被報道通過影響TRAF6 降解從而調節(jié)TLR 通路［23］。有研究報道VISTA 阻斷抗體聯(lián)合TLR激動劑（包含了CpG、R848等）明顯延長黑色素瘤荷瘤小鼠生存時間［23］。在另一篇研究里，VISTA阻斷抗體聯(lián)合TLR激動劑（包含了LPS、PolyI：C等）也同樣在小鼠黑色素瘤皮下模型中顯示出比單藥治療更加強大的抗腫瘤能力［17］。另外，非肌層浸潤性膀胱癌經尿道膀胱腫瘤電切術后常規(guī)使用卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）預防復發(fā)［1，24］。BCG 本身也能激活TLR 通路［25，26］，因此VISTA 抗體聯(lián)合BCG也是潛在的膀胱癌免疫治療方案。

綜上所述，本研究初步鑒定了高表達VISTA的膀胱癌免疫微環(huán)境組成情況，且VISTA 與PD-1/PD-L1 同時高表達與惡性腫瘤特征相關。小鼠皮下膀胱癌模型中聯(lián)合應用VISTA 和PD-1 抑制劑能夠協(xié)同抑制腫瘤生長，為新的膀胱癌免疫治療聯(lián)合方案提供了理論依據(jù)。