蔡典葵，李昂，楊思加，韋金星，閔軍

肝癌是最常見的癌癥之一，在2020 年新發(fā)病例約為9.06 萬人，相關死亡人數(shù)約為83 萬人；肝癌是世界上常見的第六大癌癥，也是第三大癌癥相關死亡病例［1］。近年來，病人的預后隨著肝癌治療水平的提高而逐步好轉［2］。但是肝癌病人總體預后仍然不容樂觀。所以，尋找新的診療目標刻不容緩。

高遷移率基團核小體結合蛋白（high mobility group nucleosome-binding protein，HMGN）是脊椎動物細胞細胞核內普遍表達的非組蛋白染色質結構蛋白家族［3］。HMGN 基因家族共有5 個成員，分別是能與核小體特異性結合的HMGN1、HMGN2、HMGN3、HMGN4 和HMGN5。在近年的研究中，有一些證據(jù)顯示HMGN 基因家族在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色［4-15］，但是僅有少量研究表明HMGN 基因家族對肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［16-18］，這些研究都是單獨調查，缺乏系統(tǒng)的分析。

在本研究中，我們從TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫中提取HMGN 基因家族的表達和臨床數(shù)據(jù)，并結合GEPIA 數(shù)據(jù)庫對HMGN 基因家族進行系統(tǒng)分析。在為肝癌患者帶來福音的同時，探索新的診療目標，也為后續(xù)的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 TCGA 和GEO

TCGA 和GEO 是開放的數(shù)據(jù)庫［19，20］。在這項研究中，我們從TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得了HMGN 基因家族在肝癌組織和正常組織中的相對表達量以及臨床數(shù)據(jù)。我們探究了HMGN 基因家族在肝癌組織和正常組織的轉錄水平差異，并比較了HMGN 基因家族在肝癌不同分期的轉錄水平差異。

1.2 GEPIA

GEPIA 是一個癌癥和正?；虮磉_譜和交互式分析的網絡服務器［21］。在這項研究中，我們通過GEPIA 的生存模板，以75%的高表達組為界，以25%的低表達組為界，分析了HMGN 基因家族中mRNA 水平與肝癌患者生存率的相關性。

1.3 LASSO 分析

在本研究中，我們通過LASSO 回歸分析，構建有意義的預后風險模型，并對模型進行檢驗驗證。根據(jù)風險評分計算公式：預后風險評分=∑（相應的回歸系數(shù)×基因mRNA 水平），我們將數(shù)據(jù)以中位數(shù)為界分為高、低風險組。同時，我們采用R 包“timeROC”評估預后風險模型，比較不同肝癌的不同階段的風險分數(shù)，比較生存和死亡病人的風險分數(shù)以及比較高、低風險組的總體生存率。

1.4 統(tǒng)計分析

采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。P≤0.05 時認為該數(shù)值具有統(tǒng)計學意義（*P≤0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）。

2 結 果

2.1 HMGN 基因家族在肝癌中高表達

為了探討HMGN 基因家族在肝癌中的表達狀況，我們通過TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫，對比HMGN 基因家族在肝癌組織和正常肝組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在正常肝組織中，HMGN1、HMGN2 和HMGN4 的表達水平明顯低于肝癌組織，而HMGN3和HMGN5在兩數(shù)據(jù)庫表達差異不一致（圖1 和圖2）。

圖1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中，HMGN 基因家族在肝癌與正常組織中的表達水平差異

圖2 在GEO 數(shù)據(jù)庫中，HMGN 基因家族在肝癌與正常組織中的表達水平差異

2.2 HMGN 基因家族的mRNA 水平與肝癌的分期顯著相關

在發(fā)現(xiàn)HMGN 基因家族在肝癌中高表達后，我們提出進一步設想：HMGN 基因家族的表達水平是否與肝癌分期有關。為了證明這一設想，我們進一步通過TCGA 數(shù)據(jù)庫對HMGN 基因家族的表達水平與肝癌分期之間的關聯(lián)性進行了分析。如圖3 所示，HMGN1、HMGN2、HMGN3 和HMGN4在肝癌Ⅰ期的表達水平顯著低于Ⅱ期和Ⅲ期，而HMGN5 差異無統(tǒng)計學意義。由此可見，肝癌的分期與HMGN 基因家族的表達水平有著顯著的相關性。

圖3 HMGN 基因家族在肝癌不同分期的表達水平差異

2.3 HMGN 基因家族的高表達與肝癌患者預后差顯著相關

我們通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析HMGN 基因家族的表達水平與肝癌患者存活率之間的相關性，以期進一步探討HMGN 基因家族的表達與肝癌患者預后之間的相關性。如圖4 所示，肝癌患者的總體生存率與HMGN1、HMGN2 和HMGN4 的表達呈負相關，而HMGN3 和HMGN5 表達量與總體生存率無統(tǒng)計學意義。如圖5 所示，HMGN1、HMGN2、HMGN3 和HMGN4 的表達量與肝癌患者無病生存率呈負相關，而HMGN5 表達量與無病生存率無統(tǒng)計學意義。同時，采用LASSO 回歸分析HMGN 基因家族，最終確認HMGN2、HMGN3 和HMGN4 構建預后風險模型的誤差最?。▓D6A-B），其預后風險模型為：風險評分=0.007028453*HMGN2 表達水平+0.001433249*HMGN3 表達水平+0.004738559*HMGN4 表達水平。風險評分預測總體生存率的AUC（曲線下面積）為0.568，說明預后風險模型有意義（圖6C）。肝癌Ⅰ期的風險評分顯著低于Ⅱ期和Ⅲ期，說明肝癌患者的分期與危險評分密切相關（圖6D）。肝癌患者的生存狀態(tài)與風險評分密切相關，存活的肝癌患者的風險評分比死亡的肝癌患者的風險評分低（圖6E）。肝癌患者的生存時間與危險評分密切相關。與低風險組相比，高風險組預后較差（圖6F）。

圖4 HMGN 基因家族的表達水平與肝癌患者總體生存率的相關性

圖5 HMGN 基因家族的表達水平與肝癌患者無病生存率的相關性

圖6 肝癌中HMGN 基因家族的風險預后模型

3 討 論

我們首次對肝癌中HMGN 基因家族進行了全面系統(tǒng)的分析。與正常組織相比，HMGN1、HMGN2和HMGN4 在肝癌組織的表達較高。HMGN1、HMGN2、HMGN3 和HMGN4 在 肝 癌Ⅰ期 的 表 達水平顯著低于Ⅱ期和Ⅲ期，且HMGN1、HMGN2、HMGN3 和HMGN4 高表達的肝癌患者的無病生存率較低，HMGN1、HMGN2 和HMGN4 高表達的肝癌患者的總體生存率較低，這些提示HMGN1、HMGN2 和HMGN4 可能是肝癌診斷和治療的潛在靶點及肝癌預后的預測標志物。通過LASSO 分析，HMGN 基因家族構建的風險預后模型能評估肝癌的預后價值，提示該模型可為肝癌診斷的早期預測及干預提供參考。

HMGN1是肝癌疫苗佐劑和開發(fā)抗腫瘤療法的理想候選物。Liu 等發(fā)現(xiàn)HMGN1 增強甲胎蛋白的慢病毒疫苗的抗腫瘤作用［17］；Zuo 等發(fā)現(xiàn)HMGN1和抗CD4 抗體的聯(lián)合治療在小鼠中發(fā)揮了強大的抗腫瘤作用［16］。然而，在本研究中，HMGN1 在肝癌中高表達，且其高表達與肝癌患者預后差相關。其原因是腫瘤細胞死亡和免疫系統(tǒng)的細胞釋放HMGN1 有助于血清HMGN1 水平的升高［22］。

HMGN2 的異常表達往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Fan 等發(fā)現(xiàn)HMGN2 能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，使其凋亡增多，并能起到抗乳腺癌的作用［6］。Hu 等發(fā)現(xiàn)HMGN2 蛋白對口腔鱗癌的生長有抑制作用［10］。然而，HMGN2 減少接頭組蛋白H1 與染色質調節(jié)區(qū)的結合，從而增強STAT5 與啟動子DNA 的相互作用，最終導致乳腺癌細胞增殖增加［9］。這些結果表明，HMGN2 對腫瘤有雙重作用，但是目前沒有HMGN2 在肝癌的相關研究。本研究首次探索了HMGN2 在肝癌的作用，發(fā)現(xiàn)HMGN2 可能是肝癌診斷和治療的潛在靶點。

HMGN3 通過轉錄因子調節(jié)染色質結構，調控轉錄，與多種癌癥的發(fā)展有關。既往研究表明，HMGN3 抑制上皮調節(jié)因子的轉錄，促進膽管癌的遷移［12］。本研究首次對HMGN3 在肝癌中的作用進行了探索，發(fā)現(xiàn)HMGN3 在肝癌不同數(shù)據(jù)庫中的表達水平不一致，其表達量與肝癌分期和無病生存率呈正相關，HMGN3 高表達組的總體生存率低于低表達組，但不具有統(tǒng)計學意義。

HMGN4是肝癌診斷和治療的潛在靶點。既往研究表明，HMGN4 在小鼠和人類細胞以及轉基因小鼠甲狀腺中的上調改變了細胞轉錄譜，下調了腫瘤抑制因子的表達，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13］。HMGN4 在stat3 介導的乳腺癌中起著關鍵作用，可能是乳腺癌治療的一個潛在靶點［11］。Xia 等發(fā)現(xiàn)HMGN4 高表達的肝癌預后較差［18］，與本研究分析預測相同。

HMGN5 與多種癌癥的發(fā)展有關。既往研究表 明，Zhu 等 發(fā) 現(xiàn)HMGN5 通 過 激 活FGF/FGFR 通路促進大腸癌的侵襲和轉移［5］；HMGN5 可能是治療膀胱癌的一個潛在靶點，對膀胱癌有臨床病理分期和預后的重要影響［14］。Mou 等發(fā)現(xiàn)HMGN5是乳腺癌的一種新的表觀遺傳學治療靶點［15］。目前沒有HMGN5 在肝癌的相關研究，我們的研究首次探索HMGN5 在肝癌的作用，發(fā)現(xiàn)在TCGA 數(shù)據(jù)庫中，HMGN5 在肝癌和正常組織的表達水平無明顯差異，而在GEO 數(shù)據(jù)庫中，HMGN5 在肝癌低表達，其表達量與臨床預后無關。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者中HMGN1、HMGN2 和HMGN4 表達水平上調，與肝癌患者的臨床預后差相關。但是本研究缺乏實驗驗證，并且肝癌具有很強的異質性，需要通過細胞實驗和動物實驗進一步闡明HMGN 基因家族在肝癌中的作用。