程諾，任慶旗，袁建玲，吳柳盛，林澤偉*

肝細(xì)胞癌（HCC）是如今威脅人類(lèi)健康主要的惡性腫瘤之一，在全世界所有的腫瘤當(dāng)中，HCC 的發(fā)病率占到第四位，病死率占到第二位［1］。中國(guó)是個(gè)HCC 大國(guó)，每年HCC 的新病例總數(shù)可達(dá)40 萬(wàn)例，占全球HCC 每年新發(fā)病總數(shù)的一半［2］。目前針對(duì)HCC 的根治手段有手術(shù)切除、肝移植和射頻消融等。但是HCC 的復(fù)發(fā)率較高，即使行根治切除肝癌腫塊的患者，術(shù)后5 年的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率可達(dá)40%～70%［3］。而其中，MVI 是影響HCC 患者預(yù)后的重要因素之一，MVI 陽(yáng)性與患者術(shù)后的高復(fù)發(fā)率密切相關(guān)［4］。但目前針對(duì)MVI 的診斷方法主要依賴(lài)于術(shù)后病理檢查，而術(shù)前MVI 的評(píng)估卻尚未有可靠的預(yù)測(cè)模型。因此若能準(zhǔn)確地在術(shù)前對(duì)HCC 患者進(jìn)行MVI 評(píng)估，將為患者的精準(zhǔn)治療提供重要參考，例如為HCC 患者術(shù)前手術(shù)方式的選擇和肝移植患者的篩選提供參考等［5］。雖然現(xiàn)在已有部分學(xué)者嘗試?yán)眯g(shù)前的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物或影像學(xué)檢查幫助預(yù)測(cè)MVI，但其中大部分效果欠佳，這些不足主要體現(xiàn)為低敏感性方面［6］。而ctDNA 作為一種新型的液體活檢分子，與腫瘤分子的突變具有一致性，現(xiàn)已被證實(shí)與多種腫瘤的診斷及預(yù)后相關(guān)，但是目前與MVI 相關(guān)的研究較少。因此本文旨在研究關(guān)于術(shù)前ctDNA 與MVI 的關(guān)聯(lián)性，從而為術(shù)前肝癌患者的MVI 的預(yù)測(cè)尋求潛在的檢測(cè)指標(biāo)，并為HCC 患者術(shù)前精準(zhǔn)化治療提供的參考。

1 方法與資料

1.1 一般資料

本研究回顧分析了2018 年4 月至2021 年9 月于北京大學(xué)深圳醫(yī)院行根治性肝癌切除術(shù)的59 例HCC 患者的臨床資料。對(duì)于其納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡在18～85 歲之間自愿加入該研究；②符合2022 年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》被診斷為肝癌［7］；③所有患者均為首次手術(shù)且術(shù)前未進(jìn)行其他抗腫瘤治療；④術(shù)前臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝外轉(zhuǎn)移或其他原發(fā)性腫瘤；②術(shù)前合并嚴(yán)重感染患者。該研究的研究方案已通過(guò)北京大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有參與者在入組時(shí)簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 ctDNA 的采集和分析

抽取所有患者術(shù)前一周內(nèi)的外周血樣本10 mL以獲取ctDNA 樣本，具體步驟：①將外周血樣本低溫超速離心獲取血漿；②對(duì)獲取的血漿使用循環(huán)核酸試劑盒提取ctDNA；③構(gòu)建ctDNA 的DNA 文庫(kù)并利用PCR 擴(kuò)增文庫(kù)；④記錄文庫(kù)中每條DNA片段長(zhǎng)度（FS）大小，計(jì)算150 bp 的序列占總體片段的數(shù)值；⑤測(cè)序健康個(gè)體全基因組序列；⑥將ctDNA 的DNA 文庫(kù)與健康體細(xì)胞基因組序列對(duì)比，并利用以下算法量化計(jì)算量化后的拷貝數(shù)畸形（CNA）的具體數(shù)值以降低檢測(cè)結(jié)果的噪聲；⑦結(jié)合得到的CNA 和FS 指標(biāo)構(gòu)建ctDNA 評(píng)分系統(tǒng)。具體CNA 的計(jì)算方法如下：

每1Mb 區(qū)域j 中的測(cè)序箱中，RDj指所在區(qū)域j的CNA 調(diào)用次數(shù)，RDj指健康細(xì)胞的區(qū)域j的平均調(diào)用次數(shù)，SDj為其標(biāo)準(zhǔn)差，如果測(cè)序箱區(qū)域j的Z得分＜-3 或＞3，則判定區(qū)域j 為CNA 狀態(tài)，計(jì)算總體基因的CNA 箱數(shù)，從而量化總體的CNA 程度。

1.3 MVI 的判斷方法

術(shù)中采集患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行病理分析，原發(fā)性肝癌的微循環(huán)血管浸潤(rùn)的判定參照2022 年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》進(jìn)行標(biāo)本的取材，分級(jí)符合M0 的患者定義為MVI 陰性；分級(jí)符合M1、M2 的患者定義為MVI陽(yáng)性。

1.4 觀察指標(biāo)

收集肝癌患者術(shù)前可能影響肝癌微血管侵犯的相關(guān)因素：性別、年齡、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（PLR）、血小板與淋巴細(xì)胞比值（NLR）、甲胎蛋白（AFP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）、活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）、異常凝血酶原（PIVKA-II）、是否感染乙肝、BCLC 分期、TNM 分期、腫瘤數(shù)量、腫瘤大?。ㄒ阅[瘤最大徑判定）。由于入組的病例均為符合手術(shù)治療指征病例，因此無(wú)TNM分期四期的病例納入此次研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文所有的數(shù)據(jù)分析采用SPSS（版本23.0）數(shù)據(jù)分析軟件。①采用受試者工作特征曲線（ROC）確認(rèn)MVI 相關(guān)因素的最佳截?cái)嘀?；②采用logistics分析模型確認(rèn)進(jìn)行MVI 相關(guān)單因素分析；③對(duì)單因素分析挑選的因素采用多因素logistics 分析確認(rèn)獨(dú)立危險(xiǎn)因素；④對(duì)性別、年齡是否大于50、PLR是否大于100、NLR 是否大于2、AFP 是否大于400、ALT 是否大于40、TBIL 是否大于12、ALB 是否=大于35、APTT 是否大于39.5、PIVKA-II 是否大于40、是否感染乙肝、BCLC 分期、TNM 分期、腫瘤為單發(fā)或多發(fā)、腫瘤是否大于3.5 cm和MVI是否為陽(yáng)性的分類(lèi)資料在不同ctDNA 水平的組間比較采用卡方檢驗(yàn)比較；⑤使用R 軟件（版本4.2.1）的rms 包繪制列線圖。P值＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 隨訪結(jié)果

本研究總共有59 名患者納入研究隊(duì)列當(dāng)中，所有患者均已接受根治性肝癌切除手術(shù)的治療，手術(shù)過(guò)程順利，術(shù)后標(biāo)本送病理檢查。在59例患者中，MVI 陰性患者有22 例，MVI 陽(yáng)性的患者有37 例。其中男性50 人，女性9 人，中位年齡54 歲（29 ～81 歲）。

2.2 術(shù)前ctDNA 評(píng)分預(yù)測(cè)患者有無(wú)MVI 效能的ROC 曲線分析

結(jié)果顯示ctDNA 的最佳截?cái)嘀禐?.80（ROC曲線下面積為0.813，靈敏度為0.65，特異性為0.86，95%CI：0.654～0.885）（見(jiàn)圖1）。

圖1 ctDNA 評(píng)分對(duì)術(shù)前預(yù)測(cè)肝癌患者微血管侵犯效能的受試者工作曲線分析

2.3 對(duì)影響MVI 的因素進(jìn)行單因素分析評(píng)估

結(jié)果顯示：ALT＞40 U/L，較晚的TNM、BCLC 分期，腫瘤最大徑＞3.5 cm 和ctDNA ＞0.80 與肝癌MVI的發(fā)生有關(guān)（P＜0.05）。（見(jiàn)表1）。

表1 患者微血管侵犯可能影響因素的單因素分析

2.4 對(duì)單因素分析挑選的因素進(jìn)行多因素分析

ctDNA＞0.80、較晚的TNM 分期，腫瘤最大徑＞3.5 cm 是影響肝癌MVI 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（見(jiàn)表2）。

表2 患者微血管侵犯的可能影響因素的多因素分析

繪制列線圖：根據(jù)表2 中得出的各獨(dú)立危險(xiǎn)因素繪制出評(píng)估預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌MVI 風(fēng)險(xiǎn)的列線圖，通過(guò)圖1，我們可以將圖中各因素對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)相加得出總分，從而計(jì)算對(duì)應(yīng)的MVI 風(fēng)險(xiǎn)值，以1 例57 歲男性肝癌患者為例，該患者ctDNA 評(píng)分0.9940685409760150，TNM 分期為1 期，腫瘤最大徑＞3.5 cm，總分約為122 分，因此參照?qǐng)D1 該患者約有80%的可能性MVI 為陽(yáng)性（圖2）。

圖2 預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌MVI 的列線圖

2.5 分組分析

依據(jù)ctDNA 評(píng)分的截?cái)嘀祵?9 例患者分為高ctDNA 評(píng)分組和低ctDNA 評(píng)分組，其中高ctDNA 評(píng)分組為27 例，低ctDNA 評(píng)分組為32 例。結(jié)果顯示：AFP ＞400 ng/mL、TBIL ＞12 μmol/L、APTT ＞39.5 s、PIVKA-II ＞40 mAU/mL、腫瘤最大徑＞3.5 cm、BCLC 分期及微血管侵犯陽(yáng)性的患者中高ctDNA 評(píng)分的例數(shù)分別為12、22、14、16、23、24 例，而低ctDNA 評(píng)分的例數(shù)為5、16、7、9、16、13 例。兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 不同水平ctDNA 評(píng)分的肝癌患者臨床特征的比較［n］

3 討 論

HCC作為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著我國(guó)國(guó)民的健康。目前的研究表明MVI 陽(yáng)性的HCC 患者在接受窄切緣切除手術(shù)及射頻消融后預(yù)后較差［8］。因此術(shù)前預(yù)測(cè)肝癌MVI可幫助挑選手術(shù)方式并提高患者預(yù)后。ctDNA 作為一種有腫瘤來(lái)源的細(xì)胞外DNA（cfDNA），具有許多腫瘤基因組DNA 相同的分子特異性，現(xiàn)已被證實(shí)與多種腫瘤的診斷及預(yù)后相關(guān)，但是目前ctDNA 與MVI相關(guān)的研究較少，因此本文嘗試評(píng)估術(shù)前ctDNA與肝癌MVI 的相關(guān)性。

根據(jù)以往的研究顯示，腫瘤在侵犯血管后會(huì)使ctDNA 更易被檢測(cè)出來(lái)［9］，且癌細(xì)胞突變后會(huì)獲得更強(qiáng)的侵襲性［10］。由于ctDNA 與肝癌細(xì)胞DNA 具有一致性，通過(guò)評(píng)估術(shù)前ctDNA 的畸變程度可以反映HCC 的MVI 發(fā)生情況。

回顧以往的研究結(jié)果，腫瘤的大小與MVI 密切相關(guān)［11］，本研究也證明了這一點(diǎn)。Eguchi等人［12］的研究發(fā)現(xiàn)隨著患者腫瘤直徑增大，患者肝癌發(fā)生MVI 的概率也就越高。而大部分研究顯示腫瘤的數(shù)量也是MVI 的獨(dú)立影響因素［13］，但是本研究中的MVI 依賴(lài)術(shù)后病理確診，所有患者的術(shù)前評(píng)估均符合2022 年國(guó)家衛(wèi)健委頒布的《肝癌防治指南》的手術(shù)治療指征，眾多多發(fā)腫塊的肝癌患者僅采取了經(jīng)皮肝動(dòng)脈栓塞、射頻消融等其他治療方式而無(wú)法入組，從而產(chǎn)生了選擇偏倚的可能，可能減弱腫瘤數(shù)量與MVI 的相關(guān)性。

有研究顯示一些血清學(xué)中的炎癥相關(guān)指標(biāo)也與MVI 發(fā)生密切相關(guān)，例如NLR、LYM［13］。Deng等［14］收集了大量的數(shù)據(jù)樣本，利用其中多種炎癥指標(biāo)、AFP 和腫瘤大小構(gòu)建了一套針對(duì)HCC 患者M(jìn)VI 的術(shù)前預(yù)測(cè)系統(tǒng)。然而當(dāng)機(jī)體遇到心肌梗死、中風(fēng)和自身免疫病等導(dǎo)致組織損傷異常疾病狀態(tài)時(shí)，其中的cfDNA 會(huì)異常升高［15］。在本次實(shí)驗(yàn)前我們的預(yù)分析顯示處于感染狀態(tài)的病人的ctDNA 評(píng)分也會(huì)異常增高。因此為避免異常感染的患者對(duì)最終結(jié)果的影響，我們將其排除在入組病人之外，但這也產(chǎn)生了選擇偏倚，故而本次單因素分析未發(fā)現(xiàn)與MVI 相關(guān)的炎性指標(biāo)。

本文通過(guò)淺層測(cè)序得出ctDNA 的拷貝數(shù)畸形及片段數(shù)大小的兩個(gè)指標(biāo)，并將其結(jié)合計(jì)算出ctDNA 變異度的量化指標(biāo)，再將收集了共59 名患者對(duì)應(yīng)的相關(guān)臨床指標(biāo)與MVI 術(shù)后病理結(jié)果，經(jīng)過(guò)單因素多單因素分析，最終結(jié)果顯示：ctDNA＞0.80、較晚的TNM 分期，腫瘤最大徑＞3.5 cm 是影響肝癌MVI 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，外周血中的ctDNA含量是影響肝癌患者M(jìn)VI 發(fā)生的重要因素。

綜上，術(shù)前外周血ctDNA 對(duì)于肝癌患者M(jìn)VI的發(fā)生具有預(yù)測(cè)效能，能夠?yàn)榛颊咝g(shù)前患者精準(zhǔn)治療提供參考，但本研究納入的患者數(shù)量較少，同時(shí)如前所述目前本研究中患者的MVI 的判斷依賴(lài)于術(shù)后病理，而對(duì)于入組患者中手術(shù)指征的評(píng)估又在客觀上導(dǎo)致了部分指標(biāo)分析的選擇偏倚，后續(xù)需入組更多患者，綜合考慮各種因素作進(jìn)一步深入研究。