王 琴，陳子端，陳林偉

南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州附屬醫(yī)院，江蘇 泰州 225300

氣血雙補(bǔ)方是著名中醫(yī)學(xué)家孟景春教授的臨床驗方［1-5］，該方由人參、炙黃芪、酒當(dāng)歸、酒炒白芍、陳皮、玉竹、酒黃精、制首烏、枸杞子等9味中藥組成，該方具有補(bǔ)益氣血、通陽散結(jié)、活血通絡(luò)、復(fù)脈固脫等功效，主要用于治療慢性心衰（chronic heart failure，CHF）疾?。?］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)“氣血雙補(bǔ)方”中的黃芪、當(dāng)歸、白芍、何首烏、黃精炮制配伍后的復(fù)方特征圖譜發(fā)生了顯著變化，且臨床研究發(fā)現(xiàn)炮制后治療CHF的功效明顯增強(qiáng)，但其炮制增效的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

微量元素又稱痕量元素，是指小于人體體質(zhì)量0.01%的元素，人體內(nèi)共含有微量元素41種，必需微量元素14 種，雖然微量元素在體內(nèi)總量很少，但其參與人體生命活動的各個環(huán)節(jié)，主要包括充當(dāng)酶的輔基、參與核酸蛋白質(zhì)代謝、抗腫瘤、生長發(fā)育、保護(hù)心血管、維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能、提高機(jī)體免疫力等，目前生物無機(jī)化學(xué)在分子水平方面揭示了微量元素的體內(nèi)作用機(jī)制，而微量元素含量測定為闡明中藥作用機(jī)制提供一定參考。

前期研究發(fā)現(xiàn)氣血雙補(bǔ)方能降低CHF 模型大鼠體內(nèi)丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，提高總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量，對損傷心肌具有一定抗氧化保護(hù)作用［7］。同時對氣血雙補(bǔ)方中21種微量元素的測定結(jié)果表明復(fù)方中富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Mn、Se、Al等微量元素，且研究表明SOD 依賴Cu、Zn、Fe 發(fā)揮生物活性，而Se 濃度與SOD 活性密切相關(guān)［8］。因此，本課題提出假說氣血雙補(bǔ)方炮制后是否通過調(diào)節(jié)體內(nèi)微量元素增強(qiáng)對損傷心肌的抗氧化保護(hù)作用，進(jìn)而對CHF 產(chǎn)生炮制增效作用。本研究擬通過比較CHF 模型大鼠灌胃生品和炮制品前后血清Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 14 種微量元素含量變化，闡釋氣血雙補(bǔ)方抗CHF的炮制增效作用。

1 材料

1.1 實驗動物健康SD 雄性大鼠20 只，體質(zhì)量（220±20）g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002，購自杭州醫(yī)學(xué)院。

1.2 儀器WX-4000 型微波消解系統(tǒng)（上海屹堯微波化學(xué)技術(shù)有限公司）；ISO9001 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；iCAP-6300 型電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific）。ICP-AES工作條件見表1。

1.3 試劑Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L，100 mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號：19603-1）；硝酸（分析純，500 mL，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：190722）；過氧化氫（分析純，500 mL，南京化學(xué)試劑有限公司，批號：190802）；阿霉素（分析純，上海源葉生物科技公司，批號：20191215）；水為經(jīng)Millipore Milli-Q 水處理系統(tǒng)處理后的去離子水；氣血雙補(bǔ)生品和炮制品水煎液來自泰州市中醫(yī)院藥學(xué)部。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，進(jìn)行方差分析，采用SIMCA 14.1多元分析軟件進(jìn)行聚類分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 SD 大鼠心衰模型的建立及微量元素含量檢測建立CHF 大鼠模型：將SD 大鼠置于正常實驗環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)，正常提供食物和水，保證12 h光照周期。將15 mg 阿霉素溶于4 mL 生理鹽水中，配置濃度為3.75 mg/mL，大鼠腹腔注射給藥劑量為2.5 mg/kg，大鼠給藥體積約0.2 mL。兩周內(nèi)分6 次注射，累積劑量15 mg/kg，即2、4、6、8、10、12天給藥，觀察并確認(rèn)大鼠心力衰竭癥狀。將CHF SD 模型大鼠20 只隨機(jī)分為氣血雙補(bǔ)方生品組和炮制品組，每組10只，分別灌胃0.74 g/kg的復(fù)方生品及炮制品水煎液，每天灌胃3 次，灌胃4 周后眼眶取血檢測血清Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 14 種微量元素含量。灌胃后兩組大鼠血清Mg、Ca、Zn、Se 元素含量高于灌胃前（P＜0.05），炮制品組Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Se 元素高于生品組（P＜0.05），說明氣血雙補(bǔ)方炮制前后微量元素含量發(fā)生了變化。進(jìn)一步通過OPLS-DA 分析氣血雙補(bǔ)方炮制前后大鼠血清中差異性微量元素，同時建立VIP 圖，由圖得知?dú)庋p補(bǔ)方中差異性微量元素VIP＞1的元素主要有Fe、Mg、Ca、Zn、Se、Cu 及Mn 元素，表明大鼠血清中Fe、Mg、Ca、Zn、Se、Cu 及Mn 元素含量炮制后發(fā)生了顯著變化。見圖1—2及附表1。

圖1 氣血雙補(bǔ)方炮制品與生品組大鼠血清聚類分析

圖2 VIP圖（OPLS-DA分析）

附表1 兩組大鼠灌胃前后血清中各微量元素含量（n=10） μg/mL

2.2 樣品測定精密量取兩組血清樣品溶液各0.2 mL 于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入1 mL HNO3，1 mL 30%H2O2，密閉封裝后，微波消解，140 ℃微波消解2 min，微波功率為500 W；然后升溫至220 ℃，微波功率為1000 W，保持5 min，消解后冷卻，移入5 mL 量瓶中，定容并搖勻，即得供試品溶液，按上述方法制備樣品空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液）連續(xù)進(jìn)樣5次，計算各元素RSD范圍均在1.12%～2.07%之間，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一血清樣品平行測定5次，計算得到Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 各元素RSD 范圍均在1.23%～2.21%之間，表明該檢測方法穩(wěn)定可靠。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液），分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣6 次，計算各元素RSD 范圍均在0.86%～1.25%之間，表明儀器穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收試驗 取已知含量的動物血清消解后的供試液，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算14 種元素的平均加樣回收率范圍為93.21%～104.82%，RSD為1.12%～2.64%（n=5）。

3 討論

炮制改變了微量元素的質(zhì)和量，能使人體必需微量元素溶出量增加，有害元素溶出量降低，并借助輔料中微量元素的作用更好地發(fā)揮中藥材療效［9］。并且炮制輔料中含有豐富的有機(jī)成分和無機(jī)微量元素，對藥物的質(zhì)量和療效起重要作用［10］。目前關(guān)于中藥中微量元素的功效尚不明確，其可能與有機(jī)成分并存形成配合物發(fā)揮藥效有關(guān)。

本研究通過微量元素探討氣血雙補(bǔ)方抗CHF的炮制增效作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃炮制品后CHF 動物模型大鼠血清中Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn及Se元素含量高于生品組。Cu、Zn、Se是人體重要的抗氧化酶金屬離子，對心肌具有保護(hù)作用；研究表明SOD依賴Ca、Cu、Zn、Mg、Fe、Mn 元素發(fā)揮生物活性，而Se、Cu、Zn、Fe、Mn濃度與SOD活性密切相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)e、Ca、Zn、Se、Cu及Mn元素與抗氧化保護(hù)作用密切相關(guān)，與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氣血雙補(bǔ)方能降低CHF 模型大鼠體內(nèi)MDA 含量，提高SOD 和GSH-Px 含量，對損傷心肌具有一定的抗氧化保護(hù)作用相吻合。因此，氣血雙補(bǔ)方炮制后可能通過提高M(jìn)g、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn及Se元素含量進(jìn)一步發(fā)揮抗CHF 的炮制增效作用，其更深層次作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。