李子娟，王雁彬，韓 杰，張曉園，李廷荃△

1 山西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，山西 太原 030024；2 山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西 太原 030024； 3 山西省中醫(yī)院，山西 太原 030000

下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans of the lower extremities，ASOLE）是指由于動脈硬化造成的內(nèi)膜增厚、管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域供血不足的一系列疾病，主要表現(xiàn)為下肢皮溫降低、間歇性跛行、疼痛，易引起肢體末端壞疽，導(dǎo)致截肢［1-2］。鹿茸具有補(bǔ)腎、填精、益髓的功效［3］，前期研究表明，鹿茸能夠促進(jìn)ASOLE大鼠血管新生［4］，但具體機(jī)制尚未明晰。磷脂酰肌醇3-羥基激酶（phosphatidy linositol 3-hydroxykinase，PI3K）是蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的上游信號分子，可通過激活A(yù)kt 來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路和細(xì)胞功能變化，在血管新生中發(fā)揮重要作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測ASOLE模型大鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子1α多肽（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）的含量以及骨髓中EPCs 凋亡率與腓腸肌中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）的陽性表達(dá)探討鹿茸通過PI3K/Akt信號通路促進(jìn)ASOLE大鼠血管新生的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級雄性SD 大鼠92 只，2 月齡，體質(zhì)量250～300 g，由山西省中醫(yī)藥研究院提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：1103221911003889。

1.2 飼料制備高脂飼料（80.3%基礎(chǔ)飼料、15%豬油、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、4%膽固醇）。

1.3 藥物與試劑鹿茸采用馬鹿茸，購自北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，用普通粉碎機(jī)粗粉后再用氣流超微粉碎機(jī)制成微粉（粒徑＞10 μm），溫水調(diào)，攪拌均勻，即用即配。PI3K抑制劑LY294002購于美國Selleck公司中國分公司（美國輝瑞公司授權(quán)經(jīng)銷商），用DMSO 配置母液（10 mg LY294002溶于6.5075 mL DMSO），于-20 ℃冰箱保存，每日配置當(dāng)日所需溶液（10%母液+40%PEG300+5%Tween-80+45%生理鹽水），即用即配；維生素D3針劑（哈爾濱摩天農(nóng)科獸藥有限責(zé)任公司，批號：20190318）；ELISA試劑盒（Elabscience 公司，貨號E-EL-R2603c）；VEGF抗體、HIF-1α抗體（abcam公司，貨號：145056）；TUNEL 試劑盒（凱基生物科技有限公司，批號：20200623）。

1.4 儀器微型高速離心機(jī)（Labnet 公司，美國）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（ASONE 公司，日本）；全自動酶標(biāo)儀（Thermo scientific 公司，美國）；顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）；切片機(jī)（萊卡公司，德國）；離心機(jī)（北京離心機(jī)廠）；電子天平（METTER 公司，瑞士）；移液器（EPPENDORF 公司德國）；干燥箱、低溫冰箱（三洋公司，日本）；恒溫水浴箱（江蘇太倉醫(yī)用儀器廠）；醫(yī)用微波爐（浙江臨安愛迪儀器廠）；脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組，每組10 只，鹿茸低、中、高劑量組及LY294002+鹿茸低、中、高劑量組，每組12只。

1.5.2 下肢動脈硬化閉塞癥模型制作 1）將大鼠以5%水合氯醛溶液（7 mL/kg）腹腔麻醉，隨后取平臥位，固定于手術(shù)臺，左側(cè)腹股溝備皮；2）碘伏消毒左側(cè)腹股溝區(qū)域后，行一長約1.5 cm 縱切口，暴露血管鞘，分離股動脈及其分支，齒鑷沿股動脈走形鉗夾約30 s，分別結(jié)扎并離斷左側(cè)股動脈分支；3）用0 號線縫合皮下組織及皮膚，背部皮下注射生理鹽水10 mL 補(bǔ)液抗休克治療，大鼠各項生命體征平穩(wěn)后放回鼠籠；4）30萬單位青霉素肌肉注射3天預(yù)防感染；5）高脂飼料喂養(yǎng)12周；6）予維生素D3（30萬U/kg）右下肢肌肉注射，每月1次［7］。

1.5.3 給藥方法 鹿茸低、中、高計量組分別灌胃［0.143、0.286、0.572 g/（kg·d）］鹿茸溶液。LY294002 組腹腔注射LY294002［1 mg/（kg·d）］；正常組、模型組及假手術(shù)組灌胃等容量蒸餾水。LY294002+鹿茸低、中、高計量組先腹腔注射LY294002 再灌胃鹿茸溶液。于造模第一天開始給藥，每日1次，28天后處死大鼠。

1.5.4 標(biāo)本采集及處理方法 將大鼠麻醉后，用小鑷子摘去一只眼球，收集外周血到EP 管中；取大鼠術(shù)側(cè)下肢腓腸肌，立即凍存于液氮中，并存儲于-70 ℃冰箱待用。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 一般狀態(tài) 觀察大鼠一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、毛色、皮溫及活動靈敏度等。

1.6.2 大鼠外周血清中VEGF、HIF-1α含量ELISA檢測 實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均平衡至室溫；試劑或樣品配制時需充分混勻，并盡量避免起泡；分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品或樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL。給酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干，不洗板，每孔中加入生物素抗體溶液100 μL，酶標(biāo)板加覆膜，37 ℃溫育1 h；棄去液體，洗板3次，每次浸泡30 s，大約350 μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干；每孔加酶結(jié)合物溶液100 μL，加覆膜，37 ℃溫育30 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次；每孔加底物溶液（TMB）90 μL，酶標(biāo)板加覆膜37 ℃避光孵育15 min 左右。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量各孔光密度（OD值）。

1.6.3 骨髓中EPCs 凋亡率TUNEL 檢測 標(biāo)本經(jīng)分層離心涂片后：1）4%多聚甲醛固定30 min；樣本 片 浸 入PBS 漂 洗3 次，每 次5 min；2）配 置1%Triton X-100 通透液，將樣本片浸入通透液中，室溫促滲3～5 min；之后浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；3）配置3% H2O2封閉液，樣本片浸入封閉液中，室溫（15～25 ℃）封閉10 min；樣本片浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；4）配置TdT 酶反應(yīng)液，每個樣本滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片放入溫盒中，37 ℃避光反應(yīng)30 min；反應(yīng)后得樣片浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；5）每個樣本滴加50 μL 避光配置的Streptavidin-HRP 溶液，37 ℃避光反應(yīng)30 min；反應(yīng)后的樣片浸入PBS漂洗3 次，每次5 min；6）配置DAB 溶液顯色；7）蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片后熒光顯微鏡下觀察；每例切片計數(shù)5 個200 倍視野，以平均每100個細(xì)胞中所含凋亡細(xì)胞個數(shù)計算凋亡率。

1.6.4 腓腸肌中VEGFR含量免疫熒光技術(shù)檢測 涂片后用多聚甲醛固定10 min；用PBS 溶液微振蕩洗滌5 min×2次。加0.4% Triton-X100破膜5～10 min，用PBS 微振蕩洗滌3 min×3 次；用1%PBS封閉液室溫封閉30 min～1 h；用0.5% PBS 稀釋一抗，比例為1∶100；4 ℃過夜；從冰箱拿出后37 ℃復(fù)溫45 min；或室溫2～3 h；或37 ℃ 1 h；孵育后用PBS 微振蕩洗滌5 min×3 次；用0.5%PBS稀釋二抗，比例為1∶400；室溫30 min 1 h；孵育后用PBS 微振蕩洗滌5 min×3 次；DAPI 原液為1 g/mL，稀釋濃度為1∶1000，快速染色10 s，用蒸餾水沖洗；用防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)空白組、假手術(shù)組大鼠精神良好，毛色光澤，活動靈敏，下肢溫度正常；模型組、各給藥組大鼠最初1 個月增長迅速，后增長減緩，且精神萎靡，活動欠靈敏，毛色暗淡，下肢溫度降低。

2.2 外周血清中VEGF與HlF-1α含量與空白組相比，模型組及各給藥組VEGF及HIF-1α水平降低（P＜0.01），各給藥組VEGF 及HIF-1α水平高于模型組（P＜0.01）；其中鹿茸高劑量組最顯著，且高于鹿茸高劑量+LY294002 組（P＜0.01）；鹿茸高劑量+LY294002組高于鹿茸中劑量組（P＜0.05）；鹿茸中劑量組高于鹿茸中劑量+LY294002組（P＜0.05）；鹿茸中劑量+LY294002 組高于鹿茸低劑量組（P＜0.05）；鹿茸低劑量組高于鹿茸低劑量+LY294002組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠外周血清中VEGF、HlF-1α含量（）

表1 各組大鼠外周血清中VEGF、HlF-1α含量（）

注：與空白組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；與模型組比較，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05；與鹿茸高劑量組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

HIF-1α 51.73±3.61△△*41.11±4.01▲△△34.39±0.37▲▲△△**32.96±0.44▲▲△△*28.09±1.87▲▲△△**24.03±0.82▲▲△△**21.52±0.94▲▲△**18.84±1.27▲▲**組別空白組鹿茸高劑量組鹿茸高劑量+LY294002組鹿茸中劑量組鹿茸中劑量+LY294002組鹿茸低劑量組鹿茸低劑量+LY294002組模型組鼠數(shù)6 6 6 6 6 6 6 6 VEGF 111.35±7.69△△**85.56±4.65▲▲△△72.78±0.98▲▲△△**67.55±2.29▲▲△△**61.97±0.79▲▲△△**59.16±0.78▲▲△△**54.22±0.99▲▲△△**50.85±0.18▲▲**

2.3 骨髓中EPCs 凋亡率 與空白組及各給藥組比較，模型組骨髓EPCs 凋亡率上升（P＜0.01）；與空白組相比，鹿茸高劑量組骨髓中EPCs凋亡率無顯著差異（P＞0.05），其中鹿茸高劑量組低于鹿茸高劑量+LY294002組（P＜0.05），鹿茸高劑量+LY294002組低于鹿茸中劑量組（P＜0.01），鹿茸中劑量組低于鹿茸中劑量+LY294002組（P＜0.05），鹿茸中劑量+LY294002 組低于鹿茸低劑量組（P＜0.01），鹿茸低劑量組低于鹿茸低劑量+LY294002組（P＜0.01）。見表2。

表2 TUNEL檢測給藥后骨髓中EPCs凋亡率（）

表2 TUNEL檢測給藥后骨髓中EPCs凋亡率（）

注：與空白組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；與模型組比較，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05；與鹿茸高劑量組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

EPCs凋亡率8.2±2.86△△7.8±2.59△△11.6±0.90▲△△*15.8±1.92▲▲△△**18.4±1.14▲▲△△**21.4±1.52▲▲△△**26.2±2.28▲▲△△**38.6±4.72▲▲**組別空白組鹿茸高劑量組鹿茸高劑量+LY294002組鹿茸中劑量組鹿茸中劑量+LY294002組鹿茸低劑量組鹿茸低劑量+LY294002組模型組鼠數(shù)55555555

2.4 腓腸肌中VEGFR 陽性表達(dá) 模型組及各給藥組VEGFR陽性表達(dá)低于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組VEGFR陽性表達(dá)升高（P＜0.05）；其中各給藥組VEGFR 陽性表達(dá)由高到低依次為鹿茸高劑量組、鹿茸高劑量+LY294002 組、鹿茸中劑量組、鹿茸中劑量+LY294002 組、鹿茸低劑量組、鹿茸低劑量+LY294002 組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1—2。

圖1 免疫熒光法測定腓腸肌中VEGFR陽性表達(dá)比例

圖2 腓腸肌中VEGFR陽性表達(dá)（免疫熒光法）

3 討論

動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是由于血管動脈粥樣硬化斑塊的不斷擴(kuò)大和繼發(fā)血栓引起動脈管腔狹窄甚至閉塞，出現(xiàn)患肢慢性或急性缺血癥狀［8-10］。因此，改善缺血區(qū)域血流灌注促進(jìn)血管新生成為治療的重要步驟之一?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，鹿茸可促進(jìn)血液生成和運(yùn)行，而鹿茸的主要成分鹿茸多肽對表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，可以加速瘡面愈合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化及遷移，促進(jìn)病變部位血管生成［11］。

HIF-1α是維持內(nèi)環(huán)境氧平衡的核心調(diào)控因子，調(diào)控一系列缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，HIF-1α結(jié)合VEGF基因并啟動轉(zhuǎn)錄過程，最終導(dǎo)致VEGF在細(xì)胞內(nèi)累積［12］，VEGF 是促進(jìn)血管生成的重要因子，通過與內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）表面的VEGFR 結(jié)合，誘導(dǎo)下游促細(xì)胞存活相關(guān)通路激活，如PI3K/Akt信號通路，以促進(jìn)EPCs 增殖［13-14］。EPCs 來源于骨髓，具有自我增殖和多向分化潛能，并可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，不僅參與胚胎時期血管新生，同時也在成人血管新生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］。LY294002 是常見的PI3K/Akt信號通路阻斷劑，可完全抑制PI3K 磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt通路影響血管生成［16-17］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血清中HIF-1α、VEGF含量以及腓腸肌中VEGFR 陽性表達(dá)鹿茸高劑量組最高，鹿茸中劑量組與鹿茸低劑量組依次降低，同時PI3K/Akt 抑制劑LY294002 組HIF-1α、VEGF 含量和VEGFR 陽性表達(dá)低于相應(yīng)鹿茸劑量組；骨髓中EPCs 凋亡率鹿茸高劑量組最低，鹿茸中劑量與低劑量依次升高，含有LY294002組EPCs凋亡率高于同劑量對應(yīng)組，表明使用LY294002 抑制劑組效果差于同劑量未使用LY294002 組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。且鹿茸高劑量組效果優(yōu)于其余各組，接近空白組水平?？梢?，鹿茸通過刺激PI3K/Akt 信號通路提高了HIF-1α、VEGF 表達(dá)，增加了VEGF 含量，VEGF 與VEGFR 結(jié)合，促進(jìn)了EPCs細(xì)胞增殖，最終促進(jìn)ASOLE 大鼠血管新生。而其具體機(jī)制還需通過PI3K/Akt 信號通路其余關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢驗(yàn)。