郭潤姿 伊君梅 孫 澳 田 園 車亦偉 邱創(chuàng)鈞 王 宇

固安鼎泰海規(guī)生物科技有限公司，河北廊坊 065500

NMM[攜帶編碼腫瘤基因紐約食管鱗狀細(xì)胞癌1（NY-ESO-1）、黏蛋白1（MUC-1）、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE-A3）]腫瘤治療性DNA 疫苗裸質(zhì)粒注射液（簡稱“NMM 抗腫瘤DNA 疫苗”[1]）屬于重組生物制品，系采用大腸桿菌作為受體菌，將帶有編碼腫瘤相關(guān)基因的pNMM 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌體后制備工程菌，通過發(fā)酵、SDS 堿裂解菌體后粗純、精純等步驟而制得的質(zhì)粒DNA，主要用來治療黑色素瘤、乳腺癌、淋巴癌、皮膚癌等體表實(shí)體瘤。由于該產(chǎn)品源自大腸桿菌發(fā)酵，生產(chǎn)過程中會(huì)有大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留，宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（host cell proteins，HCPs）屬于異源蛋白，成分復(fù)雜，包括宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白以及宿主細(xì)胞分泌的催生長因子[2]，且會(huì)因生產(chǎn)過程及純化工藝的不同而發(fā)生變化。宿主菌菌體蛋白殘留是影響生物制品安全性的主要因素之一，產(chǎn)品中殘存的菌體蛋白等雜質(zhì)可能是引起機(jī)體過敏反應(yīng)的重要原因[3-4]，現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》[5]中規(guī)定對依托大腸桿菌發(fā)酵的重組生物制品中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量應(yīng)不高于0.1%，對于依托酵母菌生產(chǎn)的重組生物制品，宿主菌蛋白質(zhì)殘留量的控制更為嚴(yán)格（應(yīng)不高于0.05%）。

目前宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的分析檢測技術(shù)分為定性和定量兩種方式，其中定性的檢測方法有二維電泳法（2D-PAGE）[6]，而定量檢測的方法有酶聯(lián)免疫法[2，7]、毛細(xì)管電泳法等[8]。本研究選用美國Cygnus 公司的大腸桿菌宿主細(xì)胞ELISA 檢測試劑盒進(jìn)行檢測，該試劑盒帶有用抗大腸桿菌菌體蛋白抗體包被的酶標(biāo)板，其抗體是由包含如DH-5α、BL21、K12、JM109 等多種大腸桿菌菌體混合溶菌液反應(yīng)產(chǎn)生的。本品生產(chǎn)使用的基因工程菌為XL10-Gold，為大腸桿菌K12 系菌株中的一個(gè)變種，因此可以使用該試劑盒進(jìn)行大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定。該方法具有簡潔、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，具有較廣泛的應(yīng)用性。本研究擬從專屬性、檢測限、定量限、線性、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性等方面進(jìn)行驗(yàn)證，以便確認(rèn)該方法是否適用于NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量的檢測。

1 儀器與試劑

MB-580 型多功能酶標(biāo)儀及數(shù)據(jù)分析軟件（深圳匯松科技發(fā)展有限公司）；振蕩器。

大腸桿菌宿主細(xì)胞ELISA 檢測試劑盒（美國Cygnus）；原液空白溶劑（DNA 溶解液，主要成分：13.6 mmol/L 磷酸氫 二 鈉、3.2 mmol/L 磷酸二氫鈉、6 g/L 氯化鈉，由固安鼎泰海規(guī)生物科技有限公司制備）；NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液（批號(hào)：Bulk20200601、Bulk20200602、Bulk20200703、Bulk20200704、Bulk20200805，由固安鼎泰海規(guī)生物科技有限公司生產(chǎn)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 取試劑盒中菌體蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為0、1、3、12、40、100 ng/ml，備用。

2.1.2 檢測方法 準(zhǔn)確吸取菌體蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，原液空白溶劑以及供試品各25 μl 加入到酶標(biāo)板內(nèi)，每個(gè)溶液平行2 個(gè)復(fù)孔，每孔加入酶標(biāo)抗體100 μl，輕輕振蕩混勻，用蓋膜板蓋住酶標(biāo)板，于室溫（20℃～28℃）180 rpm 振蕩孵育90 min；小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔用350 μl 1×洗滌工作液充分洗滌5 次，每次洗板間隔10 s，用吸水紙拍干；向每孔中加入100 μl TMB 底物液，輕輕振蕩混勻，用蓋膜板蓋板后室溫（20℃～28℃）靜置孵育30 min；每孔加入100 μl 反應(yīng)終止液，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光值，并記錄各樣品于450 nm 下的吸光值；采用酶標(biāo)儀中自帶的分析軟件，以宿主菌蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得回歸方程。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線類型的選擇 目前使用ELISA 法檢測宿主菌蛋白質(zhì)殘留量數(shù)據(jù)的處理多為線性回歸模型[2，7，9]，線性回歸模型納入至各國藥典具有較長的應(yīng)用歷史，但線性回歸只是在一個(gè)范圍內(nèi)對反應(yīng)的近似模擬，真實(shí)的生物學(xué)反應(yīng)多為S 型曲線[10-12]。本研究使用四參數(shù)logistic 曲線，方程形式為y=D+（A-D）/[1+（x/C）B]，式中y表示反應(yīng)值；x表示藥物作用濃度；A、B、C、D 為4 個(gè)特征性參數(shù)，其中A為反應(yīng)下漸近線，D 為反應(yīng)上漸近線，B 為吸光值增長速率參數(shù)，C 為半數(shù)反應(yīng)濃度。通過收集大量的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)線性擬合方程的R2＞0.98，使用四參數(shù)logistic 曲線擬合方程R2值能達(dá)到0.9999 以上，表明四參數(shù)logistic 曲線擬合的方式能更準(zhǔn)確地反映樣品中宿主菌蛋白質(zhì)的含量，故選擇四參數(shù)logistic 法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4 樣品稀釋倍數(shù)的確定 將三個(gè)批次DNA 疫苗原液用原液空白溶劑稀釋5 倍作為供試品溶液，對比稀釋5 倍的供試品溶液以及DNA 疫苗原液吸光值并計(jì)算宿主菌蛋白質(zhì)含量。由表1 可知原液空白溶劑、DNA 疫苗原液以及稀釋5 倍后的供試品吸光值均與0 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品吸光值接近，宿主菌蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果均低于該試劑盒的最低有效定量限（1 ng/ml），表明原液空白溶劑對宿主菌蛋白質(zhì)的檢測無干擾，使用本方法檢測宿主菌蛋白質(zhì)含量時(shí)，DNA 疫苗原液不需要稀釋。

表1 吸光值以及宿主菌蛋白質(zhì)含量

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性 溶液A：0 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液與DNA 疫苗等比混合；溶液B：80 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液與DNA 疫苗等比混合；溶液C：40 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品；溶液A 平行3 個(gè)復(fù)孔、溶液B 平行3 個(gè)復(fù)孔，溶液C 平行6 個(gè)復(fù)孔。照2.1.2 項(xiàng)下對各溶液中宿主菌蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，溶液A 與溶液B 的含量之差如在溶液C 含量測定值的95%可信區(qū)間內(nèi)（即x±2SD），表明供試品不會(huì)對該檢測方法產(chǎn)生干擾作用。當(dāng)結(jié)果大于可信區(qū)間時(shí)，表示樣品對檢測有增強(qiáng)作用；當(dāng)結(jié)果小于可信區(qū)間時(shí)，表示樣品對檢測有抑制作用[13]。結(jié)果見表2。溶液C 含量均值為42.2581 ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)差SD值為0.73，溶液A 與溶液B 的含量之差為43.0206 ng/ml，介于x±2SD區(qū)間（40.7981 ～43.7181 ng/ml），表明DNA 疫苗原液對宿主菌蛋白質(zhì)含量的檢測無干擾。

表2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 檢測限與定量限 對0 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)測定6 次，計(jì)算吸光值x和SD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得“x+3SD”對應(yīng)的宿主菌蛋白質(zhì)的含量，即為本試劑盒的檢測限；“x+10SD”對應(yīng)的宿主菌蛋白質(zhì)含量即為本試劑盒的定量限。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知本方法的檢測限為0.41 ng/ml，定量限為0.98 ng/ml，其定量限濃度與試劑盒說明書定量限濃度1 ng/ml 相符。

2.2.3 線性和范圍 對試劑盒中0、1、3、12、40、100 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測，選用四參數(shù)方程進(jìn)行回歸分析，回歸方程為：y=9.8481+{-9.7831/[1+（x/569.7997）1.0407]}，R2值可達(dá)0.99999。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，本方法在0 ～100 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 宿主菌蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4 精密度

2.2.4.1 重復(fù)性 將試劑盒中1、12、40 及100 ng/ml的E.coliHCP 標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)6 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算上述4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液宿主蛋白含量的RSD值及回收率。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知1 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)液濃度RSD值為11.61%，變異程度較大，但仍符合試劑盒中關(guān)于低濃度下變異系數(shù)＜20% 的要求。當(dāng)?shù)鞍缀枯^高時(shí)，板孔間變異系數(shù)均＜10%。回收率測試結(jié)果也符合試劑盒關(guān)于回收率的規(guī)定（回收率：80%～120%）。見表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4.2 中間精密度 取本品（Bulk20200602）6 份進(jìn)行檢測，每份供試品測定2 次吸光值。計(jì)算6 份供試品中吸光值均值的RSD值以及宿主菌蛋白質(zhì)含量。由表4 可知6 份供試品吸光值均值RSD值為3.09%，而宿主菌蛋白質(zhì)含量均低于該方法的定量限1 ng/ml，故無評價(jià)RSD值的必要。

表4 中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 準(zhǔn)確度 將DNA 疫苗原液分別與64、80、100 ng/ml 的E.coliHCP 標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行等比混合，作為低、中、高濃度的加標(biāo)溶液（即宿主菌蛋白質(zhì)加標(biāo)量分別為32、40、50 ng/ml），每個(gè)濃度的加標(biāo)溶液平行稀釋3 份。將0 ng/mlE. coliHCP 標(biāo)準(zhǔn)液與DNA 疫苗原液等比混合作為本底溶液。照2.1.2 項(xiàng)下對各溶液中宿主菌蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，每種溶液平行3 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算低、中、高濃度加標(biāo)溶液的回收率以及RSD值。9 份溶液的加標(biāo)回收率均值為100.35%，RSD值為3.58%，該方法的準(zhǔn)確度結(jié)果良好。見表5。

表5 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 耐用性 分別由不同人員使用不同批次試劑盒對NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質(zhì)含量均在該方法的定量限1 ng/ml 左右，表明該方法耐用性良好。

2.3 樣品的測定

用該方法對5 批DNA 疫苗原液進(jìn)行檢測，宿主菌蛋白質(zhì)含量均在該方法的定量限濃度1 ng/ml左右，折算為每毫克質(zhì)粒DNA 中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量，結(jié)果顯示宿主菌蛋白質(zhì)殘留量均在1 ng/mg左右。見表6。該結(jié)果遠(yuǎn)低于相關(guān)指導(dǎo)原則[14]中規(guī)定的宿主菌蛋白質(zhì)殘留量不高于1 μg/mg 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，表明固安鼎泰海規(guī)生物科技有限公司（本公司）的純化工藝可以有效去除產(chǎn)品中宿主菌蛋白質(zhì)。

表6 5批產(chǎn)品中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量檢測結(jié)果

3 討論

大腸桿菌是原核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最普遍的基因工程菌之一，許多人細(xì)胞因子類產(chǎn)品，如注射用干擾素、人粒細(xì)胞刺激因子、成纖維細(xì)胞生長因子都是在該宿主菌中表達(dá)?；蛑委熡觅|(zhì)粒DNA 產(chǎn)品[15]以及DNA 疫苗產(chǎn)品，如子宮頸癌DNA 疫苗[16]、乙肝DNA 疫苗[17]、印度已獲批上市的新冠DNA 疫苗[18]等，亦以大腸桿菌作為生產(chǎn)用工程菌。本公司抗腫瘤DNA 疫苗也是采用大腸桿菌作為生產(chǎn)用工程菌，所以要在終產(chǎn)品中檢測菌體蛋白質(zhì)殘留量。

本研究采用山羊抗大腸桿菌菌體蛋白抗體建立的雙抗體夾心法對產(chǎn)品菌體蛋白質(zhì)殘留量進(jìn)行檢測，該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，由于該試劑盒使用了多種大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)的抗體，可作為大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量檢測的通用方法。本研究選擇四參數(shù)logistic 曲線對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可大大降低主觀因素對結(jié)果的影響，并提高計(jì)算的精確度[10]。本研究顯示DNA 疫苗對大腸桿菌宿主菌蛋白質(zhì)殘留量的檢測無干擾，本方法定量限為0.98 ng/ml，該試劑盒在12 ～100 ng/ml 的范圍內(nèi)濃度變異系數(shù)＜10%，而在低濃度（1 ng/ml 左右）下變異系數(shù)較大，但仍符合試劑盒低濃度下變異系數(shù)應(yīng)＜20%的要求。該方法具有良好的回收率，回收率均值為100.35%。經(jīng)對多批次NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示殘留量均在1 ng/mg 左右，遠(yuǎn)低于《中華人民共和國藥典》中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量不高于1 μg/mg的規(guī)定。

本研究成功建立了NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量ELISA 檢測方法，該方法具有良好的專屬性、檢測限、定量限、線性、精密度、準(zhǔn)確度。方法學(xué)研究結(jié)果表明，Cygnus 大腸桿菌宿主細(xì)胞檢測試劑盒適用于本公司生產(chǎn)的NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質(zhì)殘留量的檢測，該方法可為同類產(chǎn)品或其他依托大腸桿菌發(fā)酵的重組生物制品中宿主菌菌體蛋白質(zhì)殘留量的檢測提供參考。