劉彥吉 蒙光敏 李貴雪 吳 寧 吳遵秋

貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025

慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）又稱慢支，是氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，可定義為在2 年內(nèi)發(fā)生持續(xù)超過(guò)3 個(gè)月的慢性咳嗽咳痰。CB 與吸煙具有很強(qiáng)的因果關(guān)系，?？蛇M(jìn)展為慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心臟病等嚴(yán)重隱患，引發(fā)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1-2]。貴州省少數(shù)民族苗藥“桿努盡煙”（學(xué)名吊石苣苔，Lysionotus pauciflorus）常被當(dāng)?shù)赜糜谥委熤夤苎?、肺結(jié)核等多種疾病，療效顯著[3-4]，前期科研工作已證實(shí)苗藥“桿努盡煙”對(duì)CB 大鼠的抗感染治療有一定效果，但作用機(jī)制尚不明確[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)激活蛋白-1（activating protein-1，AP-1）作為包含c-jun、c-fos 亞基的異二聚體復(fù)合物，與炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)展有密切關(guān)系，是多種疾病的主要靶點(diǎn)[8-10]。當(dāng)機(jī)體受到某些刺激后，可誘導(dǎo)AP-1活化，活化的AP-1 還能促進(jìn)多種炎癥因子、趨化因子的表達(dá)，影響炎癥的發(fā)生進(jìn)展。故本研究通過(guò)探究“桿努盡煙”對(duì)CB 大鼠抗炎機(jī)制及其對(duì)AP-1 表達(dá)的影響，為苗藥的藥物作用的分子機(jī)制的研究提供依據(jù)，為后續(xù)藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物 50 只SD 大鼠，體重（200±20）g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：[SYXF（黔）2018-0001]，本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：200074）?！皸U努盡煙”全草于2014 年6 月采于自我國(guó)貴州省凱里市爐山鎮(zhèn)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)潘爐臺(tái)博士鑒定為苦苣苔科（Gesneriaceae）。

1.1.2 藥品、試劑及儀器 遵義牌香煙，桂龍咳喘寧[ 桂龍藥業(yè)（安徽）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20053135，規(guī) 格：0.5 g×27 粒/ 盒]，脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS，美國(guó)Sigma），c-jun 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司），c-fos 抗體（南京巴傲得生物科技有限公司），c-jun、c-fos 引物（武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司），DNA Ladder（南京諾唯贊生物科技有限公司），DAB 試劑盒（武漢博士德），生物素抗人IL-8 抗體工作液（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司）、4℃低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo），BX51TPHD-J11 型顯微鏡（日本奧林巴斯），Synergy H1 全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰BioTek），B-500 超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析）等。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 取“桿努盡煙”干樣，使用蒸餾水完全浸泡，后置于90℃恒溫水浴箱中連續(xù)浸提，待過(guò)濾后收集浸提液，再將藥物濃縮配制濃度2.5 kg/L（按生藥量計(jì)），滅菌后放入4℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將50 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)數(shù)表法分成5 組：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、“桿努盡煙”高劑量組、“桿努盡煙”低劑量組），每組各10 只。于造模第1、14 天予實(shí)驗(yàn)組各組大鼠LPS 氣管內(nèi)滴注處理，其余組每日煙熏2 次，每次30 min（4 支遵義牌香煙/箱）。造模檢驗(yàn)成功后第2 日進(jìn)行灌胃給藥干預(yù)，連續(xù)灌胃28 d，1 次/d。28 d 后將各組大鼠處死，解剖提取其肺組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠分組情況

1.2.3 測(cè)定指標(biāo) 取大鼠肺組織，HE 染色，光鏡下觀察病理形態(tài)；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定肺組織腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）水平；蛋白免疫印跡（western-blot）檢測(cè)c-jun、c-fos 含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)c-jun、c-fos mRNA 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，對(duì)各種數(shù)據(jù)分析實(shí)行分級(jí)管理。對(duì)所有資料都采用正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，對(duì)滿足正態(tài)性分布且方差齊的多組計(jì)算均數(shù)間比較用單因素方差分析，當(dāng)方差不齊時(shí)，則用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠HE染色結(jié)果比較

給藥后肺組織HE 染色?？瞻讓?duì)照組：肺臟層胸膜結(jié)構(gòu)正常；肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯改變，見(jiàn)圖1A。模型組：各級(jí)支氣管周圍和肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)均可見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，大量纖維組織增生，在局部肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥壞死病灶，見(jiàn)圖1B。“桿努盡煙”高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組：肺臟層胸膜無(wú)結(jié)締組織增生；部分支氣管、肺泡上皮細(xì)胞有輕度損傷，有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1C、圖1D?！皸U努盡煙”低劑量組：肺臟各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)正常，部分肺泡上皮細(xì)胞已變性壞死，支氣管周圍和肺間質(zhì)稍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少許纖維組織增生，見(jiàn)圖1E。

2.2 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-8含量比較

給藥28 d 后，用ELISA 法測(cè)定肺組織的TNF-α、IL-8 表達(dá)含量，模型組TNF-α、IL-8 表達(dá)較空白對(duì)照組有明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）?！皸U努盡煙”高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組TNF-α 較模型組降低（P＜ 0.01），IL-8 較模型組降低（P＜ 0.001），高劑量組降低最為顯著；低劑量組TNF-α、IL-8 較陽(yáng)性對(duì)照組均稍有增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。低劑量組大鼠肺組織TNF-α 表達(dá)較模型組降低（P＜ 0.05），IL-8 較模型組降低（P＜ 0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-8含量比較（mg/L，± s）

注 與空白對(duì)照組比較，aaaP ＜ 0.001；與模型組比較，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01，bbbP ＜ 0.001，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，cP ＜ 0.05；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-8：白介素-8

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2.3 各組大鼠肺組織中c-jun、c-fos蛋白表達(dá)比較

給 藥28 d 后，用western-blot 法 檢 測(cè)c-jun、c-fos 表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組c-jun、c-fos 表達(dá)水平均有增加，其中模型組增加最為明顯（P＜ 0.001）；與模型組比較，“桿努盡煙”高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組c-jun、c-fos 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜ 0.01），“桿努盡煙”高劑量組c-fos 表達(dá)的降低最為顯著；較模型組，“桿努盡煙”低劑量組c-jun 下降明顯（P＜ 0.05），c-fos 表達(dá)有所降低（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肺組織c-jun、c-fos 蛋白表達(dá)（n=10）

2.4 各組大鼠肺組織c-jun、c-fos mRNA表達(dá)

28 d 給藥后，檢測(cè)大鼠肺組織c-jun、c-fos mRNA 的表達(dá)如圖3 所示，與空白對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織c-jun、c-fos 的mRNA 表達(dá)均有明顯增高，以模型組表達(dá)增加更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）?！皸U努盡煙”高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肺組織c-jun、c-fos 的mRNA 表達(dá)均較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，“桿努盡煙”低劑量組c-jun mRNA 表達(dá)增高（P＜ 0.05），c-fos mRNA 有所增高（P＜ 0.01）。

圖3 各組大鼠肺組織c-jun 和c-fos mRNA 蛋白表達(dá)（n=10）

3 討論

CB 是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，主動(dòng)或被動(dòng)吸煙以及細(xì)菌病毒的反復(fù)接觸感染是CB 主要致病因素之一，故采用LPS 聯(lián)合煙熏構(gòu)建CB 大鼠模型。研究顯示“桿努盡煙”的主要有機(jī)成分包括黃酮類[11]、苯乙醇類[12]、熊果酸[13]等，均具有較好的抗炎效果。本研究結(jié)果顯示，給藥28 d 后，“桿努盡煙”藥物組大鼠一般情況得到明顯改善，炎癥有所好轉(zhuǎn)，HE 染色結(jié)果示，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況較模型組明顯減少，這提示“桿努盡煙”對(duì)CB 大鼠的治療可能有較好效果，這與胡欣等[5-7，14]前期證實(shí)的苗藥“桿努盡煙”對(duì)CB 大鼠具有一定的抗炎效果的結(jié)果一致。

研究顯示，AP-1 是目前炎癥介導(dǎo)的重要蛋白靶點(diǎn)[15]，其可通過(guò)MAPK 信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]激活A(yù)P-1 信號(hào)，傳導(dǎo)至下游介導(dǎo)炎癥遞質(zhì)釋放；也可與細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)同一類型的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），如核因子激活的B 細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)（nuclear factor kappa-B，NF-κB），通過(guò)遠(yuǎn)距離機(jī)制調(diào)節(jié)，參與炎癥的介導(dǎo)。CB 的發(fā)病機(jī)制與炎癥信號(hào)通路息息相關(guān)，故將AP-1 用作新藥物靶向療法的重點(diǎn)研發(fā)對(duì)象，可為臨床有效遏制CB 的進(jìn)展帶來(lái)新的診療方向。

本研究造模過(guò)程中，存在大鼠因?qū)β樽硭幬镞^(guò)敏而導(dǎo)致死亡的案例，但總體死亡數(shù)量不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥28 d 后，檢測(cè)大鼠肺組織AP-1 蛋白、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 以及炎癥因子TNF-α、IL-8 的表達(dá)情況，結(jié)果表明“桿努盡煙”藥物組大鼠上述成分表達(dá)量較模型組均顯著降低，因此推測(cè)桿努盡煙對(duì)可能是通過(guò)降低AP-1 蛋白的表達(dá)水平，下調(diào)下游部分炎性遞質(zhì)TNF-α、IL-8 等生成，抑制肺組織炎性細(xì)胞的過(guò)分活化，達(dá)到了抗炎治療效果。但本研究并未進(jìn)一步驗(yàn)證AP-1 和炎癥因子TNF-α、IL-8 之間具體的相關(guān)性表達(dá)，以及活化的AP-1 和炎癥因子間表達(dá)量的相關(guān)性，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，AP-1 可能在CB 的產(chǎn)生進(jìn)展中起到一定炎癥調(diào)節(jié)作用，苗藥“桿努盡煙”可通過(guò)影響其表達(dá)水平，抑制氣道炎癥。