黃 楠,彭 勃,徐 蕾,潘武廣,趙德志,郭 蕾,敖妍冉,朱 威★,潘秋輝★
(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院,上海 200072 ;2.暨南大學(xué),廣東 廣州 510632 ;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)學(xué)中心,上海 200127 ;4.廣州君赫生物科技有限公司,廣東 廣州 510663)
腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase deficiency,ADSL)缺陷癥是一種代謝性疾病,目前尚不可治愈[1]。ADSL 是腺嘌呤從頭合成代謝途徑中重要的雙功能酶,主要參與將體內(nèi)有害代謝物產(chǎn)物琥珀酰氨基咪唑甲酰胺核苷(succinylaminoimidazole carboxamide riboside,SAICAR)裂 解 催 化 形 成 氨基米唑甲酰胺核苷酸(aminoimidazole carboxamide ribotide,AICAR)的反應(yīng)[1-2]。因SAICAR 可在生理?xiàng)l件下自然降解成為SAICAr,故通常檢測(cè)SAICAr 來代表SAICAR 的含量[3]。ADSL 缺陷癥一般見于出生至嬰幼兒期,主要是由于患者體內(nèi)的ADSL 發(fā)生了突變或者缺失,導(dǎo)致嘌呤合成途徑中的有害代謝物產(chǎn)物SAICAr 在體液中過量堆積,從而影響患兒生長發(fā)育,主要涉及器官包括腦、骨骼肌、眼睛,主要癥狀有大腦發(fā)育失常、語言缺乏、小頭畸形、癲癇、肌肉痙攣、語言缺乏、運(yùn)動(dòng)呆滯等[1,4]。精胺(Spermine)大量存在于包括牛肉、豬肉和禽肉在內(nèi)的新鮮肉類中,是哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的最重要的多胺之一[5]。據(jù)報(bào)道,精胺除了在包括離子通道調(diào)節(jié)、骨骼發(fā)育、抑制脂質(zhì)形成等多種細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要作用外,還與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[5-6],但其在ADSL 缺陷癥治療中的效用尚無文獻(xiàn)報(bào)告。我們?cè)诒狙芯恐薪⒘速|(zhì)譜檢測(cè)SAICAr 的方法,首次發(fā)現(xiàn)精胺可明顯降低體外細(xì)胞SAICAr 的堆積,可能達(dá)到治療或改善ADSL 缺陷癥的目的。
人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞和人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和青/ 鏈霉素(PS)購自美國GIBCO 公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海生工生物公司;精胺購自美國Sigma 公司;SAICAr標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Thermo 公司。
A549 和MDA-MB-231 細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%FBS 和1%PS)于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 ~3 天更換一次培養(yǎng)液,選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.1 質(zhì)譜法檢測(cè)細(xì)胞及血清中SAICAr 含量 我們首先用-20 ℃預(yù)冷甲醇稀釋SAICAr 標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)譜采用PRM 模式。于正離子條件下,CE=30 V,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 μg/mL 時(shí)檢測(cè)到了SAICAr 的單一峰。之后,通過-20 ℃預(yù)冷甲醇梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線,R 方為0.9978,可滿足后續(xù)檢測(cè)需求。在此基礎(chǔ)上,我們后續(xù)研究中將精胺處理后(實(shí)驗(yàn)組)及對(duì)照組的細(xì)胞沉淀樣品用于質(zhì)譜檢測(cè),其中各組質(zhì)譜圖中的峰面積代表檢測(cè)物質(zhì)含量。由于樣品蛋白濃度不同,其代表著樣品細(xì)胞量不同。因此,將各樣品的峰面積除以各自的蛋白濃度,進(jìn)行均一化處理以后,再將各實(shí)驗(yàn)組與各自對(duì)應(yīng)的對(duì)照組進(jìn)行逐一比對(duì),計(jì)算出精胺對(duì)細(xì)胞中SAICAr 含量的影響。
1.3.2 精胺體外給藥實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞和肺鱗癌A549 細(xì)胞以每孔1.0×104的密度鋪于6 孔板中(200 μL/ 孔),置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后,實(shí)驗(yàn)組加入精胺(5 μmol/L),對(duì)照組加入同等體積的1×PBS,每組設(shè)3 個(gè)副孔,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 小時(shí)后,離心收集細(xì)胞沉淀備用,質(zhì)譜檢測(cè)各組細(xì)胞中的SAICAr 水平。
SAICAr 是嘌呤合成過程中的中間體,分子結(jié)構(gòu)式如圖所示(圖1A)。為了評(píng)估細(xì)胞及血清中的SAICAr 含量,我們需要建立一種準(zhǔn)確有效的定量方法。質(zhì)譜是目前代謝產(chǎn)物分析中最常見的技術(shù)之一,具有檢測(cè)靈敏度高、分析物質(zhì)的分子質(zhì)量范圍寬等多種特點(diǎn),可以快速、微量、精確地檢測(cè)細(xì)胞及血清中SAICAr 的含量。為了有效地檢測(cè)細(xì)胞中SAICAr 的含量,我們購買了SAICAr 的標(biāo)準(zhǔn)品用于質(zhì)譜檢測(cè)方法學(xué)的建立。質(zhì)譜采用PRM 模式,在正離子條件下(CE=30 V,標(biāo)準(zhǔn)品濃度10 μg/mL)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,質(zhì)譜能夠檢測(cè)到SAICAr 的單一峰存在(m/z=455.08098, RT=0.98 和RT=1.26)(圖1B)。同時(shí)為了后續(xù)精確測(cè)量樣品中SAICAr 含量,我們用預(yù)冷甲醇梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線,R 方為0.9978,可滿足后續(xù)檢測(cè)需求(圖1C)。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,SAICAr 在腫瘤細(xì)胞中含量較高[7],因此我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析了SAICAr 合成酶PAICS 和代謝酶ADSL 在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,挑選出了PAICS 高表達(dá)和ADSL 低表達(dá)的兩種腫瘤,乳腺癌和肺鱗癌(圖2A)。這兩種腫瘤細(xì)胞中合成酶PAICS 的高表達(dá)和代謝酶ADSL 的低表達(dá)提示其細(xì)胞內(nèi)存在高水平的SAICAr。隨后我們使用精胺處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 和肺鱗癌細(xì)胞A549,通過質(zhì)譜方法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)SAICAr 水平。結(jié)果顯示,經(jīng)過精胺處理后,兩株細(xì)胞內(nèi)SAICAr 水平均出現(xiàn)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B 和圖2C)。
圖2 精胺明顯降低體外細(xì)胞內(nèi)的SAICAr 水平
嘌呤從頭合成途徑廣泛存在于各種生物當(dāng)中,能夠?qū)?- 焦磷酸-5 磷酸核糖(PARP)轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸(IMP),隨后進(jìn)一步合成腺嘌呤核苷酸(AMP)和鳥嘌呤核苷酸(GMP)[2]。嘌呤從頭合成過程需要十個(gè)酶促反應(yīng)才能完成相應(yīng)轉(zhuǎn)化,ADSL和PAICS 是其中重要的雙功能酶[8]。ADSL 主要催化SAICAR 裂解成AICAR 以及S-AMP 生成AMP 的反應(yīng);而PAICS 為催化嘌呤從頭合成途徑第六和第七步酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶,能夠?qū)?- 氨基咪唑-4- 羧基核苷酸(CAIR)轉(zhuǎn)化為SAICAr,主要負(fù)責(zé)SAICAr 的合成[8]。我們前期已發(fā)表的研究證實(shí)通過干擾PAICS 基因的表達(dá)可有效減少人體有毒產(chǎn)物SAICAr 的積累,達(dá)到治療或改善ADSL 缺陷癥的目的[9]。因此,我們推測(cè)精胺通過降低SAICAr 水平延長ADSL 條件敲除小鼠的存活率的機(jī)制可能與干擾PAICS 表達(dá)或抑制PAICS酶活性有關(guān),但其中詳細(xì)的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。
總之,我們?cè)诒狙芯恐凶C實(shí)了精胺通過降低SAICAr 水平改善ADSL 缺陷癥的效用。值得一提的是,精胺已經(jīng)有發(fā)表已久的國際毒理數(shù)據(jù),因此在實(shí)驗(yàn)中能夠把握好安全劑量[10]。國際公開數(shù)據(jù)顯示,精胺具有較好的安全性[11]。因此,精胺在ADSL 缺陷癥藥物治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。