黃 楠，彭 勃，徐 蕾，潘武廣，趙德志，郭 蕾，敖妍冉，朱 威★，潘秋輝★

（1.同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院，上海 200072 ；2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510632 ；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127 ；4.廣州君赫生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase deficiency，ADSL）缺陷癥是一種代謝性疾病，目前尚不可治愈[1]。ADSL 是腺嘌呤從頭合成代謝途徑中重要的雙功能酶，主要參與將體內(nèi)有害代謝物產(chǎn)物琥珀酰氨基咪唑甲酰胺核苷（succinylaminoimidazole carboxamide riboside，SAICAR）裂 解 催 化 形 成 氨基米唑甲酰胺核苷酸（aminoimidazole carboxamide ribotide，AICAR）的反應(yīng)[1-2]。因SAICAR 可在生理條件下自然降解成為SAICAr，故通常檢測SAICAr 來代表SAICAR 的含量[3]。ADSL 缺陷癥一般見于出生至嬰幼兒期，主要是由于患者體內(nèi)的ADSL 發(fā)生了突變或者缺失，導(dǎo)致嘌呤合成途徑中的有害代謝物產(chǎn)物SAICAr 在體液中過量堆積，從而影響患兒生長發(fā)育，主要涉及器官包括腦、骨骼肌、眼睛，主要癥狀有大腦發(fā)育失常、語言缺乏、小頭畸形、癲癇、肌肉痙攣、語言缺乏、運動呆滯等[1,4]。精胺（Spermine）大量存在于包括牛肉、豬肉和禽肉在內(nèi)的新鮮肉類中，是哺乳動物產(chǎn)生的最重要的多胺之一[5]。據(jù)報道，精胺除了在包括離子通道調(diào)節(jié)、骨骼發(fā)育、抑制脂質(zhì)形成等多種細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要作用外，還與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[5-6]，但其在ADSL 缺陷癥治療中的效用尚無文獻報告。我們在本研究中建立了質(zhì)譜檢測SAICAr 的方法，首次發(fā)現(xiàn)精胺可明顯降低體外細(xì)胞SAICAr 的堆積，可能達到治療或改善ADSL 缺陷癥的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞和人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和青/ 鏈霉素（PS）購自美國GIBCO 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海生工生物公司；精胺購自美國Sigma 公司；SAICAr標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Thermo 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549 和MDA-MB-231 細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)液（含10%FBS 和1%PS）于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 ～3 天更換一次培養(yǎng)液，選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)譜法檢測細(xì)胞及血清中SAICAr 含量 我們首先用-20 ℃預(yù)冷甲醇稀釋SAICAr 標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)譜采用PRM 模式。于正離子條件下，CE=30 V，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 μg/mL 時檢測到了SAICAr 的單一峰。之后，通過-20 ℃預(yù)冷甲醇梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線，R 方為0.9978，可滿足后續(xù)檢測需求。在此基礎(chǔ)上，我們后續(xù)研究中將精胺處理后（實驗組）及對照組的細(xì)胞沉淀樣品用于質(zhì)譜檢測，其中各組質(zhì)譜圖中的峰面積代表檢測物質(zhì)含量。由于樣品蛋白濃度不同，其代表著樣品細(xì)胞量不同。因此，將各樣品的峰面積除以各自的蛋白濃度，進行均一化處理以后，再將各實驗組與各自對應(yīng)的對照組進行逐一比對，計算出精胺對細(xì)胞中SAICAr 含量的影響。

1.3.2 精胺體外給藥實驗 將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞和肺鱗癌A549 細(xì)胞以每孔1.0×104的密度鋪于6 孔板中（200 μL/ 孔），置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，實驗組加入精胺（5 μmol/L），對照組加入同等體積的1×PBS，每組設(shè)3 個副孔，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 小時后，離心收集細(xì)胞沉淀備用，質(zhì)譜檢測各組細(xì)胞中的SAICAr 水平。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜檢測細(xì)胞及血清中SAICAr 含量的方法學(xué)建立

SAICAr 是嘌呤合成過程中的中間體，分子結(jié)構(gòu)式如圖所示（圖1A）。為了評估細(xì)胞及血清中的SAICAr 含量，我們需要建立一種準(zhǔn)確有效的定量方法。質(zhì)譜是目前代謝產(chǎn)物分析中最常見的技術(shù)之一，具有檢測靈敏度高、分析物質(zhì)的分子質(zhì)量范圍寬等多種特點，可以快速、微量、精確地檢測細(xì)胞及血清中SAICAr 的含量。為了有效地檢測細(xì)胞中SAICAr 的含量，我們購買了SAICAr 的標(biāo)準(zhǔn)品用于質(zhì)譜檢測方法學(xué)的建立。質(zhì)譜采用PRM 模式，在正離子條件下（CE=30 V，標(biāo)準(zhǔn)品濃度10 μg/mL）進行檢測。結(jié)果顯示，質(zhì)譜能夠檢測到SAICAr 的單一峰存在（m/z=455.08098, RT=0.98 和RT=1.26）（圖1B）。同時為了后續(xù)精確測量樣品中SAICAr 含量，我們用預(yù)冷甲醇梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線，R 方為0.9978，可滿足后續(xù)檢測需求（圖1C）。

2.2 體外證實精胺具有顯著的靶向降低SAICAr水平的作用

據(jù)文獻報道，SAICAr 在腫瘤細(xì)胞中含量較高[7]，因此我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析了SAICAr 合成酶PAICS 和代謝酶ADSL 在多種腫瘤細(xì)胞中的表達水平，挑選出了PAICS 高表達和ADSL 低表達的兩種腫瘤，乳腺癌和肺鱗癌（圖2A）。這兩種腫瘤細(xì)胞中合成酶PAICS 的高表達和代謝酶ADSL 的低表達提示其細(xì)胞內(nèi)存在高水平的SAICAr。隨后我們使用精胺處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 和肺鱗癌細(xì)胞A549，通過質(zhì)譜方法檢測了細(xì)胞內(nèi)SAICAr 水平。結(jié)果顯示，經(jīng)過精胺處理后，兩株細(xì)胞內(nèi)SAICAr 水平均出現(xiàn)明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B 和圖2C）。

圖2 精胺明顯降低體外細(xì)胞內(nèi)的SAICAr 水平

3 討論與分析

嘌呤從頭合成途徑廣泛存在于各種生物當(dāng)中，能夠?qū)?- 焦磷酸-5 磷酸核糖（PARP）轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸（IMP），隨后進一步合成腺嘌呤核苷酸（AMP）和鳥嘌呤核苷酸（GMP）[2]。嘌呤從頭合成過程需要十個酶促反應(yīng)才能完成相應(yīng)轉(zhuǎn)化，ADSL和PAICS 是其中重要的雙功能酶[8]。ADSL 主要催化SAICAR 裂解成AICAR 以及S-AMP 生成AMP 的反應(yīng)；而PAICS 為催化嘌呤從頭合成途徑第六和第七步酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能夠?qū)?- 氨基咪唑-4- 羧基核苷酸（CAIR）轉(zhuǎn)化為SAICAr，主要負(fù)責(zé)SAICAr 的合成[8]。我們前期已發(fā)表的研究證實通過干擾PAICS 基因的表達可有效減少人體有毒產(chǎn)物SAICAr 的積累，達到治療或改善ADSL 缺陷癥的目的[9]。因此，我們推測精胺通過降低SAICAr 水平延長ADSL 條件敲除小鼠的存活率的機制可能與干擾PAICS 表達或抑制PAICS酶活性有關(guān)，但其中詳細(xì)的機制仍需進一步探究。

總之，我們在本研究中證實了精胺通過降低SAICAr 水平改善ADSL 缺陷癥的效用。值得一提的是，精胺已經(jīng)有發(fā)表已久的國際毒理數(shù)據(jù)，因此在實驗中能夠把握好安全劑量[10]。國際公開數(shù)據(jù)顯示，精胺具有較好的安全性[11]。因此，精胺在ADSL 缺陷癥藥物治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。