黃 楠,彭 勃,徐 蕾,潘武廣,趙德志,郭 蕾,敖妍冉,朱 威★,潘秋輝★
(1.同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院,上海 200072 ;2.暨南大學(xué),廣東 廣州 510632 ;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)學(xué)中心,上海 200127 ;4.廣州君赫生物科技有限公司,廣東 廣州 510663)
腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase deficiency,ADSL)缺陷癥是一種代謝性疾病,目前尚不可治愈[1]。ADSL 是腺嘌呤從頭合成代謝途徑中重要的雙功能酶,主要參與將體內(nèi)有害代謝物產(chǎn)物琥珀酰氨基咪唑甲酰胺核苷(succinylaminoimidazole carboxamide riboside,SAICAR)裂 解 催 化 形 成 氨基米唑甲酰胺核苷酸(aminoimidazole carboxamide ribotide,AICAR)的反應(yīng)[1-2]。因SAICAR 可在生理條件下自然降解成為SAICAr,故通常檢測SAICAr 來代表SAICAR 的含量[3]。ADSL 缺陷癥一般見于出生至嬰幼兒期,主要是由于患者體內(nèi)的ADSL 發(fā)生了突變或者缺失,導(dǎo)致嘌呤合成途徑中的有害代謝物產(chǎn)物SAICAr 在體液中過量堆積,從而影響患兒生長發(fā)育,主要涉及器官包括腦、骨骼肌、眼睛,主要癥狀有大腦發(fā)育失常、語言缺乏、小頭畸形、癲癇、肌肉痙攣、語言缺乏、運動呆滯等[1,4]。精胺(Spermine)大量存在于包括牛肉、豬肉和禽肉在內(nèi)的新鮮肉類中,是哺乳動物產(chǎn)生的最重要的多胺之一[5]。據(jù)報道,精胺除了在包括離子通道調(diào)節(jié)、骨骼發(fā)育、抑制脂質(zhì)形成等多種細胞生理過程中發(fā)揮重要作用外,還與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[5-6],但其在ADSL 缺陷癥治療中的效用尚無文獻報告。我們在本研究中建立了質(zhì)譜檢測SAICAr 的方法,首次發(fā)現(xiàn)精胺可明顯降低體外細胞SAICAr 的堆積,可能達到治療或改善ADSL 缺陷癥的目的。
人非小細胞肺癌A549 細胞和人乳腺癌MDAMB-231 細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫;胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和青/ 鏈霉素(PS)購自美國GIBCO 公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海生工生物公司;精胺購自美國Sigma 公司;SAICAr標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Thermo 公司。
A549 和MDA-MB-231 細胞用DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%FBS 和1%PS)于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 ~3 天更換一次培養(yǎng)液,選取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。
1.3.1 質(zhì)譜法檢測細胞及血清中SAICAr 含量 我們首先用-20 ℃預(yù)冷甲醇稀釋SAICAr 標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)譜采用PRM 模式。于正離子條件下,CE=30 V,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 μg/mL 時檢測到了SAICAr 的單一峰。之后,通過-20 ℃預(yù)冷甲醇梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線,R 方為0.9978,可滿足后續(xù)檢測需求。在此基礎(chǔ)上,我們后續(xù)研究中將精胺處理后(實驗組)及對照組的細胞沉淀樣品用于質(zhì)譜檢測,其中各組質(zhì)譜圖中的峰面積代表檢測物質(zhì)含量。由于樣品蛋白濃度不同,其代表著樣品細胞量不同。因此,將各樣品的峰面積除以各自的蛋白濃度,進行均一化處理以后,再將各實驗組與各自對應(yīng)的對照組進行逐一比對,計算出精胺對細胞中SAICAr 含量的影響。
1.3.2 精胺體外給藥實驗 將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231 細胞和肺鱗癌A549 細胞以每孔1.0×104的密度鋪于6 孔板中(200 μL/ 孔),置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后,實驗組加入精胺(5 μmol/L),對照組加入同等體積的1×PBS,每組設(shè)3 個副孔,繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 小時后,離心收集細胞沉淀備用,質(zhì)譜檢測各組細胞中的SAICAr 水平。
SAICAr 是嘌呤合成過程中的中間體,分子結(jié)構(gòu)式如圖所示(圖1A)。為了評估細胞及血清中的SAICAr 含量,我們需要建立一種準(zhǔn)確有效的定量方法。質(zhì)譜是目前代謝產(chǎn)物分析中最常見的技術(shù)之一,具有檢測靈敏度高、分析物質(zhì)的分子質(zhì)量范圍寬等多種特點,可以快速、微量、精確地檢測細胞及血清中SAICAr 的含量。為了有效地檢測細胞中SAICAr 的含量,我們購買了SAICAr 的標(biāo)準(zhǔn)品用于質(zhì)譜檢測方法學(xué)的建立。質(zhì)譜采用PRM 模式,在正離子條件下(CE=30 V,標(biāo)準(zhǔn)品濃度10 μg/mL)進行檢測。結(jié)果顯示,質(zhì)譜能夠檢測到SAICAr 的單一峰存在(m/z=455.08098, RT=0.98 和RT=1.26)(圖1B)。同時為了后續(xù)精確測量樣品中SAICAr 含量,我們用預(yù)冷甲醇梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線,R 方為0.9978,可滿足后續(xù)檢測需求(圖1C)。
據(jù)文獻報道,SAICAr 在腫瘤細胞中含量較高[7],因此我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析了SAICAr 合成酶PAICS 和代謝酶ADSL 在多種腫瘤細胞中的表達水平,挑選出了PAICS 高表達和ADSL 低表達的兩種腫瘤,乳腺癌和肺鱗癌(圖2A)。這兩種腫瘤細胞中合成酶PAICS 的高表達和代謝酶ADSL 的低表達提示其細胞內(nèi)存在高水平的SAICAr。隨后我們使用精胺處理乳腺癌細胞MDA-MB-231 和肺鱗癌細胞A549,通過質(zhì)譜方法檢測了細胞內(nèi)SAICAr 水平。結(jié)果顯示,經(jīng)過精胺處理后,兩株細胞內(nèi)SAICAr 水平均出現(xiàn)明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B 和圖2C)。
圖2 精胺明顯降低體外細胞內(nèi)的SAICAr 水平
嘌呤從頭合成途徑廣泛存在于各種生物當(dāng)中,能夠?qū)?- 焦磷酸-5 磷酸核糖(PARP)轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸(IMP),隨后進一步合成腺嘌呤核苷酸(AMP)和鳥嘌呤核苷酸(GMP)[2]。嘌呤從頭合成過程需要十個酶促反應(yīng)才能完成相應(yīng)轉(zhuǎn)化,ADSL和PAICS 是其中重要的雙功能酶[8]。ADSL 主要催化SAICAR 裂解成AICAR 以及S-AMP 生成AMP 的反應(yīng);而PAICS 為催化嘌呤從頭合成途徑第六和第七步酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶,能夠?qū)?- 氨基咪唑-4- 羧基核苷酸(CAIR)轉(zhuǎn)化為SAICAr,主要負(fù)責(zé)SAICAr 的合成[8]。我們前期已發(fā)表的研究證實通過干擾PAICS 基因的表達可有效減少人體有毒產(chǎn)物SAICAr 的積累,達到治療或改善ADSL 缺陷癥的目的[9]。因此,我們推測精胺通過降低SAICAr 水平延長ADSL 條件敲除小鼠的存活率的機制可能與干擾PAICS 表達或抑制PAICS酶活性有關(guān),但其中詳細的機制仍需進一步探究。
總之,我們在本研究中證實了精胺通過降低SAICAr 水平改善ADSL 缺陷癥的效用。值得一提的是,精胺已經(jīng)有發(fā)表已久的國際毒理數(shù)據(jù),因此在實驗中能夠把握好安全劑量[10]。國際公開數(shù)據(jù)顯示,精胺具有較好的安全性[11]。因此,精胺在ADSL 缺陷癥藥物治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。