王海雨 閆雷 時汀

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的第三大原因[1]。近年來，HCC 在中國的發(fā)病率和死亡率呈明顯下降趨勢，但由于國內(nèi)人口基數(shù)的龐大以及人口增長導致HCC 病例數(shù)不斷增加[2]。盡管目前在HCC 的診斷和治療策略方面取得了巨大進展，但由于缺乏HCC早期診斷生物標志物以及理想的治療靶點，且患者術(shù)后復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，導致HCC 患者的生存率仍然很低[3-4]。因此，目前迫切需要更廣泛地探索HCC 發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為HCC 的靶向治療探尋有效的生物學標志物。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸組成的缺乏蛋白質(zhì)編碼功能的RNA[5]。已有研究表明，lncRNA 能夠通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的表觀遺傳調(diào)控過程[6]。此外，越來越多的證據(jù)表明lncRNA能夠作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通過吸附微小RNA（microRNA，miRNA）在包括乳腺癌和非小細胞肺癌等在內(nèi)的腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關重要的作用[7-8]。目前關于lncRNA 核富集轉(zhuǎn)錄本1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）在HCC 發(fā)生、發(fā)展中的作用機制研究較少，因此本研究主要探討NEAT1 通過ceRNA 機制調(diào)控HCC 細胞的遷移和侵襲，為HCC 患者的治療提供新的分子治療靶標和預后標志物。

1 材料和方法

1.1 組織標本實驗

1.1.1 標本來源及臨床資料 收集2013年6月至2014年10月南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院接受手術(shù)治療的90 例患者經(jīng)組織病理檢查證實的HCC 組織及配對癌旁組織，患者中男80 例，女10 例，年齡31～78（52±11）歲；TNM分期Ⅰ期59例、Ⅱ期23例、Ⅲ期2例、Ⅳ期6 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84 例。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，包括放化療、靶向治療以及射頻消融等治療。隨訪截止時間至2019年5月，死亡32例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2 NEAT1 和miR-342-3p 相對表達水平檢測 將HCC 組織及配對癌旁組織進行研磨、參照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和U6 為內(nèi)參，參照熒光定量PCR 試劑盒說明書使用熒光定量PCR 儀對NEAT1和miR-342-3p表達水平進行qRT-PCR檢測，采用2-ΔΔCt法計算NEAT1和miR-342-3p相對表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2 細胞實驗

1.2.1 材料與試劑 人正常肝細胞株（LO2）以及4 株HCC 細胞（Hep3B、Huh7、HepG2 和HCCLM3）購自中國科學院上海細胞庫，F(xiàn)BS 和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，Trizol 試劑和Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司，熒光定量PCR 試劑盒購自日本Takara 公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司，NEAT1干擾片段（si-NEAT1）、miR-342-3p 類似物/抑制劑（miR-342-3p mimics/inhibitor）、NEAT1 野生型（wildtype，WT）和突變型（mutant-type，MUT）雙熒光素酶報告載體均由上海吉瑪公司構(gòu)建合成，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司，所有引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司。使用Starbase2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）以及TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov）生物信息學數(shù)據(jù)庫驗證NEAT1 與miR-342-3p 的潛在結(jié)合位點。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將HepG2以及LO2細胞株培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5% CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞狀態(tài)，根據(jù)細胞狀態(tài)判斷是否需要更換培養(yǎng)液，待細胞生長至80%密度后進行傳代培養(yǎng)。實驗所用的細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報告實驗 取對數(shù)生長期HepG2 細胞并用含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基制備成濃度約1×106個/ml 的單細胞懸液，以濃度為5×105個/孔均勻接種在6 孔板中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的孵育箱中孵育24 h，待細胞密度達到80%左右，參照轉(zhuǎn)染試劑盒提供的說明書進行轉(zhuǎn)染。配置A 液：將5 μl si-NEAT1 或5 μl 陰性對照干擾片段（si-NC）加入到250 μl 的低血清培養(yǎng)基中，輕柔混勻靜置5 min；B液：將5 μl Lipofectamine 2000 加入到250 μl 的低血清培養(yǎng)基中，輕柔混勻靜置5 min，將A 液和B 液混勻并靜置20 min，緩慢加入到相應6 孔板中，繼續(xù)將轉(zhuǎn)染后的細胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過qRT-PCR 檢測si-NEAT1-1、si-NEAT1-2 和si-NEAT1-3 3 種siRNA 的干擾效率。通過構(gòu)建含有miR-342-3p 結(jié)合位點的WT 和MUT NEAT1 雙熒光素酶報告載體，使用Lipofectamine 2000 將雙熒光素酶報告載體或陰性對照與miR-342-3p mimics 共轉(zhuǎn)染至HCC 細胞中，48 h 后測定熒光素酶活性。

1.2.4 NEAT1 和miR-342-3p 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。根據(jù)Trizol 試劑盒說明書提取HCC 細胞株和LO2 細胞株的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，參照熒光定量PCR 試劑盒說明書使用熒光定量PCR 儀對NEAT1 和miR-342-3p 表達水平進行qRT-PCR 檢測，采用2-ΔΔCt法計算NEAT1 和miR-342-3p 表達水平，所用引物序列見表1。qRT-PCR 檢測NEAT1/miR-342-3p 的反應條件分別為：95℃預變性30 s/10 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，共40 個循環(huán)。實驗重復3 次。

1.2.5 細胞遷移和侵襲能力檢測 采用Transwell 實驗。用胰蛋白酶消化并收集對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)基將si-NC 組、si-NEAT1 組以及si-NEAT1+miR-342-3p inhibitor 組細胞調(diào)整為5×107個/ml 密度的懸液備用，參考Transwell 試劑盒提供的說明書，取250 μl 細胞懸液加入到Transwell 小室上層中（侵襲實驗是在Transwell 小室底部加入試劑盒配套的Matrigel基底膜基質(zhì)膠），在Transwell 小室下層中加入500 μl含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。將Transwell 小室取出，用潔凈棉簽小心地擦拭小室上層殘留的培養(yǎng)基以及未穿過小室的細胞，將小室置于4%多聚甲醛溶液中固定30 min，取出晾干后進行結(jié)晶紫染色，用倒置顯微鏡隨機計數(shù)各組5 個高倍鏡視野（×400 倍）穿膜細胞數(shù)并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件。計量資料用表達，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用例（%）表達，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。將HCC 組織中NEAT1 表達水平排序，低于中位數(shù)為NEAT1 低表達組，高于中位數(shù)為NEAT1 高表達組，采用Kaplan-Meier 曲線評估NEAT1 對HCC 患者總體生存率（接受治療以后，在特定隨訪時期內(nèi)沒有發(fā)生癌癥相關死亡群體的比率）和無復發(fā)生存率（接受治療以后，在特定隨訪時期內(nèi)沒有癌癥復發(fā)群體的比率），NEAT1 低表達組和高表達組之間生存率的差異比較采用log-rank 檢驗。采用Cox 比例風險模型探討影響HCC 患者不良預后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織標本實驗

2.1.1 NEAT1、miR-342-3p 在HCC 組織中的表達 與癌旁組織相比，NEAT1 在HCC 組織中的相對表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1A；miR-342-3p 在HCC 組織中的相對表達水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1B。NEAT1 相對表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM 分期以及復發(fā)情況有關，NEAT1相對表達水平越高，HCC患者腫瘤細胞越傾向于淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，TNM分期值越高，且更容易復發(fā)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤數(shù)目、HBsAg狀態(tài)以及血清甲胎蛋白（alpha-fetoproteins，AFP）水平均無關（均P＞0.05），見表2。

圖1 NEAT1、miR-342-3p 在HCC 組織及癌旁組織中的相對表達水平（A：NEAT1 在HCC 組織及癌旁組織中的相對表達水平；B：miR-342-3p 在HCC 組織及癌旁組織中的相對表達水平）

表2 HCC 組織中NEAT1 表達水平與患者臨床病理參數(shù)間的關系[例（%）]

2.1.2 NEAT1 表達水平與HCC 患者生存率及預后的相關性 生存分析發(fā)現(xiàn)，在TNM Ⅰ期（NEAT1 高表達組25 例，NEAT1 低表達組34 例）、TNM Ⅱ期（NEAT1 高表達組12 例，NEAT1 低表達組11 例）、TNM Ⅰ～Ⅳ期（NEAT1 高低表達組各45 例）的HCC 患者中，NEAT1低表達組患者的總體生存率均高于NEAT1 高表達組患者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），NEAT1 低表達組患者的無復發(fā)生存率均高于NEAT1 高表達組患者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，HCC 組織中NEAT1 高表達是HCC 患者預后較差的獨立危險因素（P＜0.01）。見表3。

圖2 HCC 患者NEAT1 高低表達組的生存曲線（A、D：TNM Ⅰ期總體生存率和無復發(fā)生存率；B、E：TNM Ⅱ期總體生存率和無復發(fā)生存率；C、F：TNM Ⅰ～Ⅳ期總體生存率和無復發(fā)生存率）

表3 HCC 患者預后影響因素的Cox 回歸分析

2.2 細胞實驗

2.2.1 NEAT1 對HCC 細胞遷移和侵襲能力的影響 4株HCC 細胞中NEAT1 表達水平均高于LO2 細胞株，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3A（插頁）。HepG2 細胞株轉(zhuǎn)染si-NEAT1-1 后NEAT1 表達的下調(diào)效果最明顯（P＜0.05），見圖3B（插頁），因此本實驗選擇si-NEAT1-1 進行體外細胞功能實驗。Transwell 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾NEAT1 能夠抑制HepG2 細胞的遷移和侵襲能力，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3C（插頁）。

圖3 下調(diào)NEAT1 對HepG2 細胞的遷移和侵襲能力的影響（A：NEAT1 在HCC 細胞株和正常細胞株中的表達水平；B：NEAT1 干擾片段的篩選；C：轉(zhuǎn)染si-NEAT1 能夠抑制HepG2 細胞的遷移和侵襲能力）

2.2.2 雙熒充素酶報告實驗 通過使用人類miRNA靶標預測工具Starbase2.0 并結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫，預測NEAT1 可能是miR-342-3p 的靶標，預測結(jié)合位點見圖4A。轉(zhuǎn)染si-NEAT1 干擾片段后，miR-342-3p 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4B。此外，使用雙熒光素酶報告實驗進一步驗證NEAT1 和miR-342-3p 之間的是否存在結(jié)合位點，通過構(gòu)建與miR-342-3p 具有結(jié)合位點的NEAT1-WT 和NEAT1-MUT 雙熒光素酶報告質(zhì)粒，見圖4C。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-342-3p mimics 能夠抑制NEAT1-WT 表達載體的熒光素酶活性（P＜0.05），但NEAT1-MUT 表達載體的熒光素酶活性沒有變化，見圖4D。

圖4 NEAT1 在HepG2 細胞中作為ceRNA 調(diào)控miR-342-3p 表達（A：通過生物信息學數(shù)據(jù)庫對NEAT1 和miR-342-3p 的結(jié)合位點進行預測；B：下調(diào)NEAT1 后miR-342-3p 的表達水平變化；C：NEAT1-WT 和MUT 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建；D：共轉(zhuǎn)染miR-342-3p mimics 和NEAT1-WT 或MUT 雙熒光素酶報告質(zhì)粒后熒光素酶活性變化）

2.2.3 miR-342-3p 在HCC 細胞遷移和侵襲中的作用 Transwell 實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染si-NEAT1 能夠抑制HepG2 細胞的遷移和侵襲能力（P＜0.05）。聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-NEAT1+miR-342-3p inhibitor后發(fā)現(xiàn)，與單獨轉(zhuǎn)染si-NEAT1 相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)染組HepG2 細胞的遷移和侵襲能力增強（P＜0.05）。結(jié)果表明，下調(diào)miR-342-3p 能夠逆轉(zhuǎn)敲減NEAT1 介導的HCC 細胞遷移和侵襲的抑制作用，見圖5（插頁）。

圖5 轉(zhuǎn)染si-NEAT1 以及聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-NEAT1+miR-342-3p inhibitor 對HepG2 細胞遷移和侵襲能力的影響（A：聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-NEAT1+miR-342-3p inhibitor 能夠逆轉(zhuǎn)si-NEAT1 對HepG2 細胞遷移和侵襲的抑制作用；B：轉(zhuǎn)染si-NEAT1 以及聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-NEAT1+miR-342-3p inhibitor 遷移細胞數(shù)；C：轉(zhuǎn)染si-NEAT1 以及聯(lián)合轉(zhuǎn)染si-NEAT1+miR-342-3p inhibitor 侵襲細胞數(shù)）

3 討論

如今，HCC 已成為腫瘤相關死亡的主要原因之一[9]，盡管近年來在HCC 的診斷和治療方面已經(jīng)取得了巨大進步，但由于許多HCC 患者往往在后期極易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，導致患者的預后很不理想[10]。因此，闡明HCC 發(fā)生、發(fā)展的分子機制至關重要。越來越多的研究表明，lncRNA 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程發(fā)揮著至關重要的作用。例如，Yan 等[11]通過體外實驗證明lncRNA H19 的過表達可能會促進乳腺癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移以及上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。Liu 等[12]發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA AGAP2-AS1 的表達能夠抑制HCC 的轉(zhuǎn)移和增殖能力。有研究報道，NEAT1 在胃癌中高表達，且促進胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制胃癌細胞的凋亡，同時高表達NEAT1 與胃癌患者的不良預后密切相關[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1 在HCC 組織和細胞中的表達水平明顯升高。此外，NEAT1 的表達與HCC 轉(zhuǎn)移、TNM 分期以及復發(fā)密切相關。生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TNM Ⅰ期、TNM Ⅱ期和TNM Ⅰ～Ⅳ期的HCC 患者中，高表達NEAT1 組患者總體生存率均低于NEAT1 低表達組患者。此外，多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，NEAT1 的高表達是HCC 患者預后不良的獨立危險因素。通過Transwell 實驗發(fā)現(xiàn)，體外敲減NEAT1 表達后，HepG2細胞的遷移和侵襲能力降低。以上數(shù)據(jù)表明，NEAT1在HCC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關重要的作用，且與HCC 的轉(zhuǎn)移、復發(fā)以及預后密切相關，提示NEAT1 可能會成為HCC 患者潛在的治療靶點和預后標志物。

研究發(fā)現(xiàn)miR-342-3p在多種腫瘤組織和細胞中表達水平下調(diào)，并能通過ceRNA 機制參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程。比如lncRNA H19 能夠通過ceRNA 機制競爭結(jié)合miR-342-3p進而促進膽囊癌細胞的遷移和侵襲能力[14]。LINC01503能夠發(fā)揮ceRNA功能，通過吸附miR-342-3p 促進非小細胞肺癌的增殖、遷移以及侵襲能力[15]。本實驗通過生物信息學數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NEAT1 與miR-342-3p存在互補序列，且miR-342-3p在HCC組織中表達水平下調(diào)，在HCC 細胞中敲減NEAT1 能夠促進miR-342-3p 的表達。此外，雙熒光素酶報告實驗證實NEAT1和miR-342-3p存在結(jié)合位點。Transwell實驗進一步證明NEAT1 可能通過ceRNA 機制結(jié)合miR-342-3p進而調(diào)控HCC細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NEAT1 在HCC 中表達水平升高，并與HCC 患者轉(zhuǎn)移、TNM 分期、復發(fā)以及預后具有一定的相關性。此外，體外實驗進一步表明NEAT1能夠通過ceRNA 機制調(diào)控miR-342-3p 進而誘導HCC細胞的遷移和侵襲。因此，NEAT1 可能會成為HCC 患者潛在的預后標志物以及分子治療靶點。