黃飛 祝丹 陳啟蘭

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）為臨床常見病、多發(fā)病，我國現(xiàn)有CHD 患者約1139 萬，城鄉(xiāng)居民CHD 死亡率持續(xù)上升[1]，給公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。西醫(yī)規(guī)范治療存在藥物不耐受或療效不佳，介入等方式也存在血運(yùn)重建不完全或微血管功能障礙等問題[2]。中醫(yī)藥治療CHD 歷史悠久，療效顯著，有著廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。通冠益心方（Tongguan Yixin Prescription，TGYXP）為浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方，主要應(yīng)用于氣虛血瘀型CHD 患者，能有效緩解胸悶胸痛、氣短乏力等心絞痛癥狀。TGYXP 由加味丹參飲和消瘰丸化裁而成，由黃芪、丹參、赤芍、檀香、浙貝、玄參、水蛭、三七粉等8 味中藥組成，方中黃芪善益氣健脾補(bǔ)肺，大補(bǔ)宗氣，氣旺以助血行，且免祛瘀傷正之虞，丹參、檀香活血祛瘀，行氣止痛，氣血并調(diào)，浙貝、玄參清熱化痰，軟堅(jiān)散結(jié)，標(biāo)本兼顧，赤芍清熱涼血，散瘀止痛，水蛭破瘀血而不傷新血，性遲緩善入而擅消堅(jiān)積，三七粉化瘀不傷正，止血不留瘀，諸藥相合，共奏益氣活血、通絡(luò)散結(jié)之功。該方臨床療效突出，但作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體層面為切入點(diǎn)[3]，與中醫(yī)藥學(xué)的整體論相合，為揭示中藥復(fù)方復(fù)雜機(jī)制開辟新思路。本研究依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，發(fā)掘TGYXP 防治CHD 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1TGYXP 有效成分篩選和靶標(biāo)預(yù)測 經(jīng)TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/index.php）數(shù)據(jù)庫，檢索并篩選TGYXP 組成藥物的有效活性成分和作用靶標(biāo)。分別檢索“黃芪”“丹參”“赤芍”“檀 香”“浙 貝”“玄 參”“三七”，篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%，藥物類藥性（DL）≥0.18，篩選出7 味中藥主要活性成分和靶標(biāo)。

因TCMSP 數(shù)據(jù)庫未收錄水蛭，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]，利用Excel 建立水蛭活性成分表，由Pub Chem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取SMILES結(jié)構(gòu)，再將SMILES 結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，物種選擇“人類”，篩選出可能性＞10%的蛋白作用靶標(biāo)。最后在Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將靶蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2CHD 的靶標(biāo)篩選和交集靶標(biāo)獲取 在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，檢索“Coronary Heart Disease”，篩選可信度較大的基因，獲取CHD 靶標(biāo)。利用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）網(wǎng)站，對TGYXP 和CHD 靶標(biāo)取交集映射獲取兩者交集靶標(biāo)。

1.3“中藥復(fù)方-活性成分-潛在靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建用Excel 軟件VLOOKUP 函數(shù)將TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取的活性成分與上述兩者交集靶標(biāo)取映射，再整理為Network、Type 表格，經(jīng)Cytoscape 3.9.1 軟件（https://cytoscape.org/）制作“中藥復(fù)方-活性成分-潛在靶標(biāo)”圖。

1.4蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將TGYXP 治療CHD 的交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）行PPI 分析。蛋白質(zhì)物種選擇“homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“high confidence（0.900）”，隱藏游離靶標(biāo)，其余參數(shù)默認(rèn)，導(dǎo)出TSV格式數(shù)據(jù)，構(gòu)建交集靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖[5]。

1.5關(guān)鍵治療靶標(biāo)篩選 將上述TSV 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用Tools 工具欄中Network Analyzer 插件行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。篩選度值（degree），中介中心性（betweenness centrality），緊密中心性（closeness centrality）≥平均值的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶標(biāo)[5]，并構(gòu)建關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6核心靶標(biāo)GO 功能及KEGG 通路富集 經(jīng)DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對復(fù)方疾病交集靶標(biāo)開展GO 功能、KEGG 通路富集分析。獲取TGYXP 防治CHD 的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）及信號(hào)通路信息。并在微生信網(wǎng)站，繪制排名靠前的GO 功能及KEGG 通路富集氣泡圖。

1.7TGYXP 活性成分和關(guān)鍵靶標(biāo)分子對接 基于上述研究結(jié)果行分子對接驗(yàn)證，選取度值較高的活性化合物槲皮素、木犀草素、水蛭素B 為配體與核心靶標(biāo)STAT3、AKT1 為受體進(jìn)行分子對接。槲皮素、木犀草素、水蛭素B 三種化合物的二維結(jié)構(gòu)在Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫下載，再利用ChemBio 3D Ultra（https://www.chemdraw.com.cn/xiazai.html）軟件將其轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)；核心靶標(biāo)STAT3、AKT1 的蛋白結(jié)構(gòu)在PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載，將配體及受體利用AutoDock Tools（https://autodock.scripps.edu/）軟件進(jìn)行分子預(yù)處理，而后在PyMOL（https://pymol.org/2/）軟件完成分子對接[6]。

2 結(jié)果

2.1藥物活性成分與靶標(biāo)篩選 經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出活性化合物黃芪20 個(gè)，丹參65 個(gè)，赤芍29個(gè)，檀香3 個(gè)，浙貝7 個(gè)，玄參9 個(gè)，三七8 個(gè)，蛋白作用靶標(biāo)黃芪462 個(gè)，丹參931 個(gè)，赤芍158 個(gè)，檀香100 個(gè)，浙貝70 個(gè)，玄參68 個(gè)，三七253 個(gè)；綜合文獻(xiàn)信息和數(shù)據(jù)庫篩選，獲取水蛭活性化合物59個(gè)，蛋白作用靶標(biāo)1398 個(gè)。共篩選出48 種TGYXPCHD 交集靶標(biāo)對應(yīng)活性成分，見表1～2。

表1 非水蛭中藥對應(yīng)活性化合物

表2 水蛭對應(yīng)活性化合物

2.2CHD 相關(guān)靶標(biāo)篩選和交集靶標(biāo)獲取 GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到CHD 致病基因7936 個(gè)，篩選Relevance score＞25 的基因共592 個(gè)。在微生信網(wǎng)站將TGYXP 668 個(gè)藥物靶標(biāo)與CHD 592 個(gè)疾病靶標(biāo)取交集，最終得到114 個(gè)交集靶標(biāo)，見圖1。

圖1 交集靶標(biāo)、核心靶標(biāo)圖

2.3制作“中藥復(fù)方-活性成分-潛在靶標(biāo)”圖 將整理的Network、Type 表格導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件制作“中藥復(fù)方-活性成分-潛在靶標(biāo)”圖（見圖2）。篩選出有效治療活性成分黃芪9 種，丹參11 種，赤芍5 種，檀香1 種，浙貝2 種，玄參3 種，三七5 種，水蛭18 種，共有活性成分4 種。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析排名靠前的活性成分依次是槲皮素、木犀草素、水蛭素B、十六碳烯酸甲酯、山奈酚等。該網(wǎng)絡(luò)共有171 個(gè)節(jié)點(diǎn)，422 條邊，四邊形代表靶標(biāo)，圓形代表中藥，六邊形代表單藥相關(guān)活性成分，三角形代表藥物共有活性成分，V 形代表疾病，線段連接表示節(jié)點(diǎn)間相關(guān)作用關(guān)系。

圖2 中藥復(fù)方-活性成分-潛在靶標(biāo)圖

2.4PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶標(biāo)篩選 在Cytoscape 3.9.1 軟件利用Network Analyzer 插件行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯贸龉?jié)點(diǎn)的平均度值為7.524752475，平均中介中心性為168.534653465，平均緊密中心性為0.043 279131；最終排名在平均值以上的靶標(biāo)有37個(gè)。度值、中介中心性、緊密中心性均靠前的靶點(diǎn)有STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK1、MAPK14 等，見圖1。

2.5GO 功能富集分析 經(jīng)David 數(shù)據(jù)庫對復(fù)方疾病交集靶標(biāo)行GO 功能富集分析。共富集到960 條GO 條目，包含773 條生物學(xué)過程（BP），111 條分子功能（MF）和76 條細(xì)胞組分（CC）；排名從前往后BP依次為基因表達(dá)的正向調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；MF 依次為蛋白質(zhì)結(jié)合、同種型蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性；CC 依次為質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外空間等。見圖3。

圖3 GO 功能及KEGG 通路富集氣泡圖

2.6KEGG 通路富集分析 KEGG 通路共富集到153 條通路，主要為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥通路等途徑?？v軸代表名稱，橫軸代表基因比率（Gene Ratio）。氣泡越大表明該途徑基因富集數(shù)量越多，氣泡顏色偏紅色顯示富集程度越顯著，即P值越小，見圖3。

2.7分子對接結(jié)果 分子對接顯示，STAT3 與槲皮素、木犀草素、水蛭素B 最低對接能分別為-8.20、-8.60、-6.30 kJ/mol；AKT1 與槲皮素、木犀草素、水蛭素B 最低對接能分別為-7.30、-9.50、-6.00 kJ/mol。評價(jià)分子對接強(qiáng)弱一般依據(jù)成分與靶標(biāo)的結(jié)合能及形成氫鍵數(shù)量，結(jié)合能越低，氫鍵數(shù)量越多，分子結(jié)合越穩(wěn)定，兩者間作用可能性就越大，見圖4。

圖4 成分-靶標(biāo)分子對接圖

3 討論

3.1CHD 中醫(yī)機(jī)理及TGYXP 來源 CHD 在中醫(yī)范疇當(dāng)屬“胸痹”“心痛”，《金匱要略》中歸納其病因病機(jī)主要為“陽微陰弦”，“陽微”為心氣不足、心陽不振、心血虧虛和心陰虧損，“陰弦”指氣滯、寒凝、血瘀、痰濁，本病病機(jī)關(guān)鍵是本虛標(biāo)實(shí)，正虛在內(nèi)為本，陰邪干犯為標(biāo)。不通則痛、不榮則痛是其主要環(huán)節(jié)。CHD 中醫(yī)證候常為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的復(fù)合證型，本虛多見氣虛（67.17%），標(biāo)實(shí)多有血瘀（77.89%）、痰濁（43.97%）[7]。根據(jù)“脈絡(luò)積”學(xué)說[8]，CHD 的主要病理基礎(chǔ)動(dòng)脈粥樣硬化，其病位在脈絡(luò)-血管，因氣血津液運(yùn)化失常，氣滯痰濁血瘀等積聚內(nèi)生于脈，結(jié)合以上特點(diǎn)及臨床實(shí)際，依據(jù)益氣活血、通絡(luò)散結(jié)之法研制出TGYXP，該方丸藥緩圖，固護(hù)脾胃，蟲藥通絡(luò)，主要用于治療CHD 心絞痛、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后患者。

3.2關(guān)鍵活性成分的研究“中藥復(fù)方-活性成分-潛在靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)篩選出排名靠前的活性成分依次是槲皮素、木犀草素、水蛭素B、十六碳烯酸甲酯、山奈酚等。槲皮素能降低穩(wěn)定型冠心病NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性[9]，抑制炎癥指標(biāo)分泌，并能抗血小板聚集[10]，減輕三酰甘油的生成[11]；木犀草素可激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、線粒體功能、氧化應(yīng)激等途徑來減輕心肌缺血再灌注損傷[12]；水蛭素能抑制血小板聚集以抗凝血[13]，并能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖、表型分化、遷移、分泌等多種細(xì)胞生物學(xué)過程[14]。

3.3核心靶標(biāo)的研究 PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出排名靠前的核心靶標(biāo)依次是STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK1、MAPK14 等。多個(gè)STAT3 通路影響動(dòng)脈粥樣硬化[15]，IL-6/JAK2/STAT3 通路在動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和免疫細(xì)胞分化中起重要作用。IL-10/JAK/STAT3 通路激活通過其抗炎作用導(dǎo)致病灶大小、免疫細(xì)胞積累和病灶細(xì)胞模式表型的改變，另外可激活PIAS1 和SOCS-3 等途徑影響STAT3 激活來干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[16]；AKT1 為血管生成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號(hào)分子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、新陳代謝和增殖等，活化后的AKT1 可激活血管內(nèi)皮一氧化氮合成酶（eNOS），產(chǎn)生一氧化氮，進(jìn)而發(fā)揮促血管擴(kuò)張和增強(qiáng)血流量效應(yīng)[17]。

3.4功能及通路富集的研究 GO 功能富集表明，TGYXP 防治CHD 可能通過基因表達(dá)的正向調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；KEGG 通路富集表明，可能通過脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路。PI3K-Akt 在細(xì)胞增殖、血管生成、自噬等層面起重要作用，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]。MAPK 信號(hào)通路屬于炎癥通路，該通路激活后會(huì)分泌各種炎性因子而發(fā)揮炎性效應(yīng)，在心絞痛、心肌缺血等疾病治療中有重要作用[19]，生理剪切力可維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，病理剪切力則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[20]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接篩選出TGYXP 防治CHD 的主要活性成分及核心靶標(biāo)，初步闡述了涉及的主要生物過程及信號(hào)通路，從理論層面驗(yàn)證了TGYXP 可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同效應(yīng)來發(fā)揮作用。本研究局限性如下：檢索篩選的數(shù)據(jù)庫較單一，分析結(jié)果有待基礎(chǔ)研究驗(yàn)證，未能反映藥物劑量和濃度的影響。