魯偉 陳婷婷 姚軼敏

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡率的主要原因[1]。在肺癌患者中，約85%為非小細(xì)胞肺癌[2]。肺腺癌（LUAD）是非小細(xì)胞肺癌中最常見的病理類型，由于其早期病理特征不明顯、轉(zhuǎn)移時(shí)間較晚、惡性程度較高，盡管治療的手段和方法在不斷進(jìn)步，但患者5 年生存率仍不足20%[3]。如何更早地篩查和診斷LUAD，探索其驅(qū)動(dòng)機(jī)制，找到可靠的生物標(biāo)志物及判斷預(yù)后具有重要臨床意義。糖酵解代謝異常增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特征之一。糖酵解過程中乳酸的產(chǎn)生可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[4]。乳酸脫氫酶（LDH）催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的可逆反應(yīng)，在腫瘤細(xì)胞糖酵解中起關(guān)鍵作用[5]。LDH 是糖酵解的關(guān)鍵酶，與231 種癌細(xì)胞的存活和增殖有關(guān)[6]。盡管多項(xiàng)研究報(bào)告LDH 與幾種實(shí)體瘤的預(yù)后有關(guān)，但該過程的具體機(jī)制仍不清楚，可能與Warburg 效應(yīng)有關(guān)[7]。本研究旨在運(yùn)用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫、基因表達(dá)譜交互式分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫、人類蛋白圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫、Kaplan-Meier（KM）Plotter 網(wǎng)站、腫瘤免疫評(píng)估資源庫（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）在線數(shù)據(jù)庫、UCLCAN 數(shù)據(jù)庫等工具，明確LDHA、LDHB 基因在LUAD 中的表達(dá)情況以及對(duì)其進(jìn)行預(yù)后分析。

1 資料與方法

1.1獲得相關(guān)數(shù)據(jù) 我們從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載了594 個(gè)樣本（包括535 個(gè)LUAD 樣本和59 個(gè)正常肺樣本）的RNA 測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。通過TCGA 數(shù)據(jù)庫找到LDHA、LDHB 基因在其中的表達(dá)情況。

1.2驗(yàn)證基因表達(dá)情況 GEPIA 是一個(gè)用來表達(dá)分析和交互分析癌癥和正?；虻姆?wù)器，可通過單基因分析、癌種分析、多基因分析等方法得到LDHA、LDHB 基因在LUAD 癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，進(jìn)行表達(dá)水平的作圖和生存分析。

UALCAN 數(shù)據(jù)庫是一個(gè)交互式web 網(wǎng)站，可用于在線分析和尋找更多的癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)，可以進(jìn)行miRNA 的差異分析、生存分析以及靶基因預(yù)測。本研究利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析LDHA/LDHB 表達(dá)和臨床因素之間的相關(guān)性。

1.3分析診斷價(jià)值 通過“ggplot2”（用于可視化）進(jìn)行表達(dá)差異分析，獲得LDHA、LDHB 基因在LUAD組織與癌旁組織中的表達(dá)差異情況及LDHA、LDHB基因與患者臨床資料相關(guān)性分析，包括腫瘤分期、年齡、性別、吸煙等。

使用pROC 包對(duì)LUAD TCGA 數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC分析，結(jié)果用ggplot2 進(jìn)行可視化。pROC 包默認(rèn)會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)的結(jié)局順序進(jìn)行校正。利用受試者工作特征曲線（ROC 曲線），通過曲線下的面積（AUC）來確定不同標(biāo)準(zhǔn)的界限值下的疾病識(shí)別能力，判斷LDHA/LDHB 基因?qū)τ贚UAD 的診斷價(jià)值。

1.4預(yù)后相關(guān)性分析 使用survival 包進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)檢驗(yàn)并進(jìn)行擬合生存回歸，結(jié)果用survminer包以及ggplot2 包進(jìn)行可視化。如果選用了最佳分組方法（best），則對(duì)應(yīng)使用survminer 包中surv_cutpoint函數(shù)進(jìn)行最佳分組cut-off 篩選。同時(shí)可以使用KM Plotter 數(shù)據(jù)庫、HPA 數(shù)據(jù)庫的預(yù)后模塊進(jìn)行預(yù)后價(jià)值判斷的輔助驗(yàn)證。

1.5單基因GO 和KEGG 富集分析 通過“stat”R包（基礎(chǔ)包）對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行單基因pearson 相關(guān)性分析，保留滿足cor＞0.5，P＜0.05 閾值的相關(guān)性基因。通過“clusterProfiler”R 包（用于富集分析）和“ggplot2”R 包（用于可視化）對(duì)相關(guān)性基因進(jìn)行GO注釋和KEGG 通路分析。

1.6免疫浸潤相關(guān)性分析 TIMER 是一個(gè)分析腫瘤浸潤免疫細(xì)胞成分的軟件，幾乎涵蓋了所有的癌癥種類?；诟咄繙y序數(shù)據(jù)來分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況，支持6 種常見免疫細(xì)胞的分析。通過TIMER 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行免疫浸潤分析，評(píng)估LUAD 患者關(guān)鍵基因的表達(dá)與浸潤免疫細(xì)胞之間的關(guān)系。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用R version 4.0.2 軟件。采用在線統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LUAD 患者LDHA/LDHB 表達(dá)增加 利用TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的數(shù)據(jù)來分析LUAD 患者LDHA/LDHB的mRNA 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織的表達(dá)水平相比，LDHA/LDHB 在LUAD 患者中的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見圖1A）。與配對(duì)的癌旁組織相比，LUAD 患者LDHA/LDHB 的表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見圖1B）。同時(shí)，基于HPA 數(shù)據(jù)庫也發(fā)現(xiàn)LDHA/LDHB 在LUAD 中的蛋白表達(dá)，與正常肺組織相比，LDHA/LDHB 在不同抗體染色程度的LUAD 中的蛋白水平均有升高。

圖1 LDHA/LDHB 在LUAD 中的表達(dá)

2.2LUAD 患者LDHA/LDHB 表達(dá)與臨床相關(guān)性通過使用UCLCAN 在線工具，結(jié)合不同的臨床參數(shù)來調(diào)查不同情況的LUAD 患者中LDHA/LDHB 的表達(dá)。首先從性別來看，與正常對(duì)照組相比較，LDHA/LDHB 在男性和女性LUAD 患者中的表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）（見圖2A）。其次，不同腫瘤分期的LUAD 患者中均觀察到LDHA/LDHB 表達(dá)明顯上升（P＜0.05）（見圖2B）。另外，根據(jù)淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)，LUAD患者LDHA/LDHB 表達(dá)也隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)增多而顯著增加（P＜0.05），見圖2C。

圖2 LDHA/LDHB 在不同LUAD 患者中的表達(dá)

2.3ROC 曲線分析 通過TCGA 數(shù)據(jù)庫中LUAD的表達(dá)譜數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線分析其診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)LDHA 可作為區(qū)分LUAD 與正常肺部組織生物標(biāo)志物（AUC=0.952，95%CI：0.934～0.970），LDHB 在LUAD患者診斷中有一定的診斷價(jià)值（AUC=0.734，95%CI：0.693～0.775），見圖3。

圖3 LUAD 及鄰近組織中LDHA/LDHB 表達(dá)的受試者工作特征曲線分析

2.4LUAD 患者LDHA/LDHB 預(yù)后相關(guān)分析 利用不同數(shù)據(jù)庫得到的LDHA/LDHB 在LUAD 中的生存狀況來進(jìn)行預(yù)后分析。從包含LUAD 樣本與正常相鄰組織樣本的GEPIA 數(shù)據(jù)庫評(píng)估來看，LUAD 中LDHA/LDHB 的表達(dá)顯著高于正常組織（見圖4A）。此外，通過TCGA 數(shù)據(jù)庫、KM Plotter 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)也證實(shí)了LDHA/LDHB 在LUAD 中存在著過表達(dá)。KM 生存曲線綜合分析顯示，在患病后100 個(gè)月內(nèi)，LDHA/LDHB 表達(dá)較高的患者常存在著預(yù)后不良的情況（P＜0.05），見圖4B、4C。

圖4 LUAD 患者LDHA/LDHB 的總體生存期曲線

2.5LDHA/LDHB 相關(guān)基因GO 和KEGG 通路分析利用DAVID 生物信息學(xué)微陣列分析將與LDHA 最相關(guān)的前894 個(gè)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因中富集了糖酵解/糖異生、碳代謝作用和氨基酸的生物合成。為了在LDHA 高表達(dá)和生存期較短的患者中識(shí)別出調(diào)控方向相同的基因，我們將與LDHA 相關(guān)性最高的894 個(gè)基因與LUAD 中100 個(gè)存活相關(guān)上調(diào)基因進(jìn)行交集，在交叉點(diǎn)檢測到LDHA 和LUAD存活相關(guān)的49 個(gè)基因。對(duì)其GO 功能富集和KEGG途徑分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)基因在微管、中間體、染色體分離等過程中顯著富集。

同理，使用DAVID 生物信息學(xué)微陣列分析將與LDHB 最相關(guān)的前283 個(gè)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因中富集了未折疊結(jié)合蛋白、伴侶復(fù)合物。為了在LDHB 高表達(dá)和存活期較低的患者中識(shí)別出具有相同調(diào)控方向的基因，我們將與LDHB 相關(guān)性最高的299 個(gè)基因與LUAD 中100 個(gè)存活相關(guān)上調(diào)基因進(jìn)行交集，在交叉點(diǎn)檢測到與LDHB 和LUAD 存活具有相關(guān)性的49 個(gè)基因。對(duì)其進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 途徑分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)基因在微管、脫氧核糖核苷酸的代謝過程中顯著富集。

2.6LDHA/LDHB 與免疫浸潤的相關(guān)性分析 我們使用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析LDHA/LDHB 的表達(dá)與多種浸潤性免疫細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果表明，LUAD 中LDHA的表達(dá)水平與輔助型T 細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。LUAD 中LDHB 的表達(dá)水平與Th2呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與自然殺傷（NK）細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見圖5。

圖5 TIMER 數(shù)據(jù)庫中LDHA/LDHB 與不同免疫細(xì)胞的浸潤相關(guān)性散點(diǎn)圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因與免疫浸潤的相關(guān)性，通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫中探究LDHA/LDHB 表達(dá)與T 細(xì)胞檢查點(diǎn)（如CD27、CD134 和CD197）之間的相互關(guān)系。結(jié)果顯示，LDHA/LDHB 表達(dá)與LUAD 中CD27、CD134 和CD197 的表達(dá)顯著相關(guān)（P＜0.05）。見圖6。

圖6 LUAD 中LDHA/LDHB 表達(dá)與CD27、CD134 和CD197 之間相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

本研究主要基于生物信息學(xué)的方法研究LDHA/LDHB 表達(dá)水平與LUAD 的關(guān)系。研究表明，LDHA/LDHB 在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌等多種人類癌癥中普遍存在表達(dá)異常的情況[8-11]。LDH 是參與糖酵解的關(guān)鍵酶，通常通過加強(qiáng)有氧糖酵解促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12]。在本研究中，我們對(duì)不同公共數(shù)據(jù)庫中LDHA/LDHB 表達(dá)水平與LUAD 之間的關(guān)系進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)LUAD 組織中LDHA/LDHB 的表達(dá)顯著上調(diào)，LDHA/LDHB 表達(dá)水平與LUAD 的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、免疫細(xì)胞浸潤和不良預(yù)后相關(guān)。在細(xì)胞免疫方面，LDHA 的失活導(dǎo)致乳酸生成減少和腫瘤pH的中和，然后介導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞聚集，抑制腫瘤進(jìn)展[13]。LDH 相關(guān)的乳酸積累甚至可以直接破壞T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[14]。在本研究中，我們使用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析LDHA/LDHB 的表達(dá)與多種浸潤性免疫細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果表明，LUAD 中LDHA 的表達(dá)水平與Th2 細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，與B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。LUAD 中LDHB 的表達(dá)水平與Th2 細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，與NK 細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果有力證實(shí)了LDHA/LDHB 參與LUAD 免疫應(yīng)答，是抑制腫瘤免疫逃逸和免疫耐受的潛在靶點(diǎn)。

LDH 表達(dá)升高與LUAD 患者的不良預(yù)后相關(guān)。從代謝的角度來看，無論在常壓或缺氧環(huán)境中，惡性腫瘤細(xì)胞都處于糖酵解的活躍狀態(tài)，由于Warburg效應(yīng)，乳酸產(chǎn)生增強(qiáng)。LDH 是糖酵解過程中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的催化劑，癌細(xì)胞繞過氧化磷酸化利用LDHA 將丙酮酸還原為乳酸[15]。這將丙酮酸的代謝前體轉(zhuǎn)移到戊糖磷酸途徑，為癌細(xì)胞生長提供代謝基礎(chǔ)。此外，LDH 被認(rèn)為是組織破壞的指標(biāo)，在癌癥患者中，由于細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，癌細(xì)胞周期縮短，導(dǎo)致壞死風(fēng)險(xiǎn)增加。且鄰近的正常組織如肺、肝和骨可能被癌細(xì)胞侵襲[16]，這些器官的損傷也會(huì)導(dǎo)致LDH水平升高。LDH 受細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的調(diào)控，缺氧或基因突變使HIF 合成增加，進(jìn)而導(dǎo)致與血管生長、腫瘤轉(zhuǎn)移、糖酵解以及抗凋亡等一系列相關(guān)蛋白的過度表達(dá)，這有助于增加癌細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。所有這些機(jī)制可能共同促進(jìn)癌癥患者LDH 水平的升高，使其成為判斷腫瘤預(yù)后的預(yù)測因子。

綜上所述，本文研究表明LDHA/LDHB 在LUAD發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后判斷的方面發(fā)揮重要作用。通過多種數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析證明LDHA 和LDHB 參與了LUAD 的進(jìn)程，可作為LUAD 相關(guān)的一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于我們進(jìn)一步了解LDHA 和LDHB 的作用，以及為LUAD 預(yù)后評(píng)估及靶向治療提供價(jià)值。