張宇 李園鐘

結(jié)腸癌是常見消化道惡性腫瘤之一,根據(jù)WHO發(fā)布的《2020年世界癌癥進(jìn)展報(bào)告》,全球每年結(jié)腸癌發(fā)病率位于第3位,致死率位于第2位,老年人更是結(jié)腸癌的高發(fā)人群[1]。近年來,隨著外科手術(shù)治療的進(jìn)步,靶向治療、免疫治療的引入以及個(gè)體化臨床治療的廣泛應(yīng)用,結(jié)腸癌的治療取得了很大的進(jìn)步。但是,由于老年病人身體狀況較差,對放化療的敏感性及耐受性較低,預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增高[2]。因此,探討老年結(jié)腸癌病人腫瘤進(jìn)展相關(guān)指標(biāo),及早預(yù)測病人預(yù)后,并優(yōu)化治療方案尤為必要。

已有研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)與子宮內(nèi)膜癌[3]、胃癌[4]、甲狀腺癌[5]等多種惡性腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。臨床病理工作中,通常用CD68(M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)和CD163(M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)作為TAMs的標(biāo)記物[6]。最近一項(xiàng)納入68例結(jié)腸癌病人的研究證實(shí),在結(jié)腸癌組織中,CD68+、CD163+巨噬細(xì)胞的表達(dá)均高于對應(yīng)的癌旁組織[7]。巨噬細(xì)胞起源于外周循環(huán)的單核細(xì)胞,在驅(qū)化物如集落刺激因子-1(CSF-1)、趨化因子(CCL)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的作用下向腫瘤定向移動(dòng)[8]。

CCL是一類能驅(qū)化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子量分泌蛋白,根據(jù)其氨基酸序列分為C、CC、CXC、CX3C四個(gè)家族,其中CC家族成員CCL3是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的趨化因子[9]。CCL3也被稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α),是免疫微環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,主要介導(dǎo)炎癥和癌癥中免疫細(xì)胞的運(yùn)輸傳遞[10]。研究報(bào)道,CCL3參與了多種惡性腫瘤的進(jìn)展,如肝癌[11]、骨/軟骨肉瘤[12]、慢性白血病[13]、口腔鱗癌[14]等。目前,CCL3在結(jié)腸癌中的作用及其與結(jié)腸癌病人預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)合老年病人結(jié)腸癌組織樣本,分析CCL3與巨噬細(xì)胞CD68+、CD163+表達(dá)的關(guān)系,并分析結(jié)腸癌組織中CCL3不同表達(dá)水平分組間臨床病理特征及生存率的差異,以期為臨床評估老年病人結(jié)腸癌的發(fā)展和預(yù)后提供新的參考靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2014～2016年手術(shù)切除的結(jié)腸癌病人癌組織及對應(yīng)癌旁組織共78例,其中男50例,女28例,年齡62～79歲,平均(66.05±5.32)歲。所有樣本均經(jīng)病理學(xué)診斷,排除術(shù)前接受抗腫瘤治療及合并其他惡性腫瘤者。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2021-025-01),病人均簽署知情同意書。

利用GEPIA(http:// gepia.cancer-pku.cn/)檢索分析TCGA Colon Cancer(TCGA-COAD)數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌及癌旁組織(275例癌組織和349例癌旁組織)中的CCL3 RNA-Seq表達(dá)水平,比較CCL3的表達(dá)水平和TAMs相關(guān)蛋白CD68、CD163水平的相關(guān)性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及試劑

1.2.1 免疫組化檢測:樣本經(jīng)固定包埋后,制成5μm切片。脫蠟、水化后,3%H2O2室溫孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性?？乖訜嵝迯?fù)并自然冷卻,分別滴加一抗CCL3(ab259372,Abcam)、CD68(ab213363,Abcam)、CD163(ab189915,Abcam),4 ℃過夜。其余步驟根據(jù)二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書進(jìn)行。蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化。以結(jié)腸癌組織切片作為陽性對照,陰性對照以PBS替代一抗。

1.2.2 Western Blot檢測:用裂解緩沖液從組織中提取蛋白質(zhì),然后4 ℃、14 000 r/min離心15 min。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S,碧云天)測量樣品中的蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,分別加入一抗CCL3(ab259372,Abcam)、CD68(ab213363,Abcam)、CD163(ab189915,Abcam)4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液洗脫3次后二抗室溫孵育2 h。使用ECL試劑檢測蛋白條帶,并使用Alpha SP圖像分析軟件進(jìn)行半定量圖像分析。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.3 結(jié)果判定:CCL3陽性細(xì)胞為胞膜和胞質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)棕黃色的著色顆粒,從陽性腫瘤細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色深淺兩個(gè)方面評分。染色強(qiáng)度通過觀察腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞,根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞占總的觀察細(xì)胞的百分比,將CCL3陽性細(xì)胞<50%定義為低表達(dá)組,≥50%定義為高表達(dá)組。其中高表達(dá)組男27例,女15例,平均年齡(69.88±8.03)歲;低表達(dá)組男23例,女13例,平均年齡(67.47±7.73)歲,2組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性(P>0.05)。

巨噬細(xì)胞胞膜/胞漿內(nèi)含清晰的黃褐色至棕黃色顆粒狀者為 CD68+或 CD163+表達(dá)。 本研究通過計(jì)數(shù)陽性巨噬細(xì)胞的數(shù)目確定 CD68、CD163的表達(dá)。鏡下觀察陽性TAM浸潤密度最高的3個(gè)視野,并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量。取平均數(shù)作為密度計(jì)數(shù)結(jié)果,依據(jù)中位數(shù)將CD68+ 巨噬細(xì)胞數(shù)≤25/視野定為低表達(dá),>26/視野為高表達(dá);CD163+ 巨噬細(xì)胞數(shù)≤53/視野為低表達(dá),>54/視野為高表達(dá)。

1.3 隨訪 從病人術(shù)后出院即開始隨訪,每半年一次,隨訪截至2021年12月?？偵嫫?overall survival,OS) 定義為從腫瘤確診至腫瘤相關(guān)原因死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn)。CCL3在結(jié)腸癌組織和癌旁組織間的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn),不同CCL3水平與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn),生存分析采用 Kaplan-Meier法并行Log-rank檢驗(yàn)。以P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL3在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá) Western Blot檢測結(jié)果顯示,78例結(jié)腸癌病人癌組織中CCL3蛋白表達(dá)水平均高于對應(yīng)癌旁組織(1:0.012),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01),見圖1。

注:**P<0. 01圖1 Western Blot顯示CCL3在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)

通過對TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫中275例結(jié)腸癌組織和349例癌旁組織樣本進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織中CCL3水平均高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)(圖2A)。深度挖掘數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中CCL3的表達(dá)水平和巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的CD68+(圖2B)、CD163+(圖2C)呈正相關(guān)(P<0. 05)。

注:A:TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌組織CCL3表達(dá)較癌旁組織升高,*P<0.05;B:TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌組織的CCL3與CD68+表達(dá)呈正相關(guān);C:TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌組織的CCL3與CD163+表達(dá)呈正相關(guān)圖2 TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫中CCL3與CD68+、CD163+的關(guān)系

2.2 不同CCL3水平組病人臨床病理特征比較 老年結(jié)腸癌組織中,CCL3高表達(dá)組與低表達(dá)組的腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期,CD68+、CD163+表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2組腫塊位置差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

表1 老年病人結(jié)腸癌組織中CCL3表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性(n,%)

2.3 老年結(jié)腸癌病人CCL3的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 截至2021年12月,78例結(jié)腸癌病人均獲得隨訪,其中37例存活,因結(jié)腸癌死亡36例,其余5例因其他疾病死亡。隨訪時(shí)間為2～84個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為62個(gè)月。生存分析結(jié)果顯示,CCL3的表達(dá)水平與病人的生存率明顯相關(guān),其中CCL3高表達(dá)結(jié)腸癌病人5年生存率為41.4%,CCL3低表達(dá)病人為59.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌是臨床最常見的消化道惡性腫瘤之一,全世界每年約新增結(jié)腸癌120萬例,其致死率約占全部惡性腫瘤的8%[15]。研究表明,浸潤到腫瘤微環(huán)境中的TAMs與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為相關(guān)。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器,在不同的刺激下發(fā)生2種不同性質(zhì)的活化。CD68和CD163作為經(jīng)典巨噬細(xì)胞標(biāo)志物,參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程,特別是與腫瘤血管和淋巴管的生成密切相關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于68例結(jié)直腸癌組織微陣列芯的研究表明,結(jié)直腸癌組織中存在 CD68+、CD163+ 巨噬細(xì)胞,且前者與結(jié)直腸癌 TNM 分期關(guān)系密切,后者則與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,可為臨床上對結(jié)直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后評估提供一定的參考價(jià)值[7]。

趨化因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,作為免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,趨化因子及其受體之間的相互作用協(xié)調(diào)了腫瘤微環(huán)境中的免疫景觀,與炎癥類似,趨化因子介導(dǎo)免疫細(xì)胞向腫瘤運(yùn)輸,并對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接和間接的影響。臨床前研究也首次證實(shí)巨噬細(xì)胞受炎癥刺激可分泌CCL3[16]。CCL3作為一種重要的趨化因子,它與免疫監(jiān)視和免疫耐受密切相關(guān),在實(shí)體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤中是與預(yù)后高度相關(guān)的生物標(biāo)志物[17]。體外和體內(nèi)研究表明,CCL3對中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞對炎癥部位有趨化作用,基因敲除研究也證實(shí)了CCL3是單核細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞運(yùn)輸?shù)闹饕{(diào)控因子[18]。CCL3在調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境中還可以介導(dǎo)記憶性CD8+ T細(xì)胞反應(yīng);促進(jìn)樹突狀細(xì)胞在淋巴結(jié)中的歸巢。樹突狀細(xì)胞在癌癥免疫學(xué)中起著關(guān)鍵作用,CCL3的趨化作用可以通過有利于樹突狀細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的歸巢來增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。但是,也有研究發(fā)現(xiàn),CCL3的化學(xué)吸引作用可能是多方面的,除了調(diào)節(jié)樹突狀和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的運(yùn)輸外,CCL3還可以被腫瘤細(xì)胞操縱。研究表明,高水平的CCL2和CCL3與腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、TAMs和髓系來源的抑制細(xì)胞(MDSCs)的浸潤增加有關(guān),這些抑制細(xì)胞使腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視[19]。CCL3同時(shí)發(fā)揮抗腫瘤和促腫瘤的作用,這依賴它所處的疾病階段和環(huán)境,提示了CCL3相關(guān)信號的復(fù)雜性[20]。

本研究首先通過整合TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中CCL3異常表達(dá),同時(shí)與CD68+、CD163+的表達(dá)水平呈正相關(guān)。并且,本研究發(fā)現(xiàn)CCL3與結(jié)腸癌不良預(yù)后相關(guān),提示CCL3不僅是一種有效的免疫應(yīng)答和免疫激活的生物標(biāo)志物,在腫瘤診治和預(yù)后預(yù)測上也具有重要作用。進(jìn)一步利用免疫組化結(jié)果,將老年結(jié)腸癌病人分為CCL3高表達(dá)組和低表達(dá)組,發(fā)現(xiàn)CCL3水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、CD68+及CD163+陽性表達(dá)明顯相關(guān),同時(shí)CCL3高表達(dá)病人5年生存率明顯降低。

本研究的不足之處為樣本容量較小,且未進(jìn)一步驗(yàn)證CCL3對結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。有必要借助大樣本量研究來確定CCL3作為一種有前途的預(yù)后生物標(biāo)記物的價(jià)值,并進(jìn)一步研究CCL3對結(jié)腸癌的作用機(jī)制。

綜上所述,老年病人結(jié)腸癌組織中CCL3高表達(dá)與CD68+、CD163+關(guān)系密切,可作為預(yù)后不良的預(yù)測因子。