玄霄宇,范吉林,潘文超,李昱靜,祝昕杰,張世亮

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病,是冠狀動脈粥樣硬化病變引起血管管腔狹窄或阻塞、心肌缺血、缺氧或壞死。冠心病歸屬于中醫(yī)學“胸痹”范疇,常在寒邪、情緒波動、飲食失節(jié)及勞累過度等危險因素誘發(fā)下發(fā)作。流行病學研究顯示,冠心病死亡在全部心血管疾病死因的占比由1990年的29%增長到2013年的37%,2013年因冠心病死亡的病人約139.4萬例,較1990年增長了90%[1], 冠心病已成為臨床心血管系統(tǒng)的多發(fā)病,對中老年人的生命健康造成了嚴重威脅。 冠心病的發(fā)生與內(nèi)皮細胞功能損傷、炎癥反應(yīng)、血小板黏附、血栓形成、血管平滑肌的遷移與增殖等有關(guān)[2]。 臨床多采用抗血小板藥、抗凝藥、他汀類及β受體阻滯劑等治療,但應(yīng)用時存在心血管風險[3]。

中醫(yī)藥在防治冠心病方面表現(xiàn)出較大優(yōu)勢,有研究顯示,中藥能有效緩解心絞痛,調(diào)節(jié)心律失常,改善心力衰竭等[4]。 四妙勇安湯可治療脫疽之熱毒熾盛者,由清代鮑相敖收入《驗方新編》并首次稱之為“四妙勇安湯”[5],全方清熱解毒、活血止痛,于清熱解毒之中寓活血養(yǎng)血之法,氣血兼顧,恰合病機。有研究表明,四妙勇安湯的作用機制涉及抗炎、保護血管內(nèi)皮、調(diào)控血管新生、抗凝、預防血栓、調(diào)控血脂等方面[6]。孫春林[7]將60例病人分為試驗組和對照組,試驗組采用加味四妙勇安湯,對照組采用通心絡(luò)膠囊,試驗組總有效率高于對照組。有研究使用常規(guī)西藥合加味四妙勇安湯治療冠心病,結(jié)果顯示,其能顯著改善病人血脂和超敏C反應(yīng)蛋白水平[8]。四妙勇安湯臨床治療冠心病療效較好,但作用機制尚未明確,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討有效成分及作用靶點,探討其治療冠心病的作用機制。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯的活性成分和潛在靶點篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺(TCMSP)對金銀花、玄參、當歸、甘草四味中藥進行檢索,得到四妙勇安湯的所有活性成分,以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,得到四妙勇安湯的有效活性成分,并運用SwissTargetPrediction和DrugBank數(shù)據(jù)庫預測活性成分對應(yīng)的靶點,之后將藥物的潛在作用靶點錄入全球蛋白質(zhì)資源(UniProt)數(shù)據(jù)庫,將蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)化為Gene Symbol,進行基因的標準化處理。應(yīng)用Cytoscape軟件制作四妙勇安湯活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)度值(Degree值)選擇四妙勇安湯治療冠心病的關(guān)鍵活性成分。

1.2 冠心病發(fā)病機制靶點的獲取 在GeneCards和在線人類孟德爾遺傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫獲取冠心病的相關(guān)靶點。將2個數(shù)據(jù)庫得到的靶標合并去重,得到冠心病有關(guān)基因。

1.3 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將篩選獲得的四妙勇安湯藥物活性成分與冠心病疾病靶點相映射,獲取交集靶點,即四妙勇安湯治療冠心病的可能作用靶點。在Cytoscape 3.7.2軟件中將交集靶點錄入,構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,利用“Network Analyzer”功能分析構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò),節(jié)點代表藥物、有效成分、疾病、靶點;邊代表藥物與成分、成分與冠心病、冠心病與靶點的作用關(guān)系。

1.4 藥物-疾病靶點蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并篩選核心靶點 將獲得的藥物和疾病的交集靶點錄入到生物分子功能注釋系統(tǒng)(STRING)數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將得到的文件以“TSV”格式導入Cytoscape 3.7.2軟件中,根據(jù)Degree值挑選,得到藥物作用于疾病的關(guān)鍵靶點。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將藥物-疾病的交集靶點錄入到DAVID數(shù)據(jù)庫,物種選擇“Homo sapiens”,進行GO和KEGG富集分析,以P<0.05的標準篩選所獲數(shù)據(jù),選取前10條繪圖。分析關(guān)鍵活性成分作用的核心靶點及其所在的通路,利用Cytoscape軟件,選取富集最顯著的10條通路,將結(jié)果進行可視化分析。

1.6 分子對接 以關(guān)鍵成分化合物為配體,并在PubChem數(shù)據(jù)庫獲得小分子3D結(jié)構(gòu)。在PDB數(shù)據(jù)庫以分辨率低、有原始配體等條件選擇核心蛋白的3D結(jié)構(gòu)。利用PyMOL對蛋白質(zhì)進行去水等處理,導入AutoDockTools加氫,將活性成分配體和蛋白受體轉(zhuǎn)換成pdbqt格式文件,運行AutoDockTools 將二者進行對接,選擇最低結(jié)合能作為結(jié)果。以結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol為參考[9], 對結(jié)果進行評估。

2 結(jié) 果

2.1 四妙勇安湯活性成分的獲取 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到四妙勇安湯活性成分共688個,篩選后獲得有效活性成分127個,其中金銀花23個、玄參9個、當歸2個、甘草93個。去重后得到四妙勇安湯有效成分作用靶點137個。應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中有254個節(jié)點、2 774條邊,詳見圖1。菱形代表靶點,圓形代表不同藥物的活性成分,V形代表金銀花、玄參、當歸、甘草,六邊形代表不同藥物的重復成分;A1為β-谷甾醇,是金銀花、玄參、當歸的共有成分;B1為豆甾醇,是金銀花、當歸的共有成分;C1為山柰酚,是金銀花、甘草的共有成分;C2為槲皮素,是甘草、金銀花的共有成分;D1為谷甾醇,是甘草、玄參的共有成分。說明四妙勇安湯的治療作用是通過多靶點、多成分實現(xiàn)的,體現(xiàn)了中藥發(fā)揮作用的復雜性。應(yīng)用“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析,取Degree值居前8位的成分作為四妙勇安湯的關(guān)鍵活性成分,詳見表1。

圖1 四妙勇安湯活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 四妙勇安湯關(guān)鍵活性成分

2.2 四妙勇安湯治療冠心病的潛在作用靶點 檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點,去重后獲得冠心病疾病靶點5 339個,取交集得到藥物和疾病的映射靶點并繪制Venn圖,有120個藥物與疾病交集靶點,其可能是四妙勇安湯治療冠心病的潛在靶點。詳見圖2。

圖2 四妙勇安湯-冠心病交集靶點Venn圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將四妙勇安湯的4味中藥、有效活性成分、疾病及交集靶點錄入Cytoscape 3.7.2軟件中,構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。圖中三角形表示金銀花、玄參、當歸、甘草;菱形代表藥物有效活性成分;V形代表冠心病;橢圓形代表疾病與藥物的交集靶點。圖中包括233個節(jié)點,其中藥物4個、疾病1個、交集靶點120個、有效活性成分108個。

圖3 藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將獲得的藥物和疾病120個交集靶點Gene symbol錄入到STRING數(shù)據(jù)庫,設(shè)定物種為“Homo sapiens”,構(gòu)建藥物與疾病之間的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,包括120個節(jié)點、1 202條邊,平均Degree值為20;節(jié)點表示蛋白,邊表示蛋白與蛋白之間的關(guān)系,詳見圖4。通過STRING數(shù)據(jù)庫得到數(shù)據(jù)并錄入到Cytoscape 3.7.2軟件中,以Degree值≥50為條件進行篩選,得到四妙勇安湯治療冠心病的核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖,節(jié)點越大,顏色越深,表示蛋白Degree值越大;連線越粗,顏色越深,說明蛋白之間關(guān)系越密切。詳見圖5。其中5個蛋白基因的Degree值較大,推測這5個基因可能是四妙勇安湯治療冠心病的關(guān)鍵靶點,基本信息見表2。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 四妙勇安湯治療冠心病的關(guān)鍵靶點

2.5 GO富集分析 將120個藥物與疾病的交集靶點錄入到DAVID數(shù)據(jù)庫,120個基因共影響了564條生物過程,以P<0.05 為篩選條件,獲得427條生物信息,其中生物過程(BP)302條,細胞組分(CC)52條,分子功能(MF)73條。四妙勇安湯治療冠心病的生物過程涉及對缺氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)、細胞外空間、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等。詳見圖6。

圖6 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫,設(shè)置P<0.05 為過濾條件,發(fā)現(xiàn)120個交集靶蛋白基因主要富集在108條通路上,表明四妙勇安湯可能通過108條通路治療冠心病。四妙勇安湯作用于冠心病的通絡(luò)涉及TNF信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、鈣信號通路、環(huán)磷酸鳥苷酸-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(cGMP-PKG)信號通路等。篩選富集程度較高的10條通路進行圖像可視化分析,詳見圖7。應(yīng)用Cytoscape軟件將四妙勇安湯關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點-通路關(guān)系進行可視化,其中內(nèi)圈的長方形代表關(guān)鍵活性成分,中圈的菱形代表關(guān)鍵靶點,外圈的六邊形代表信號通路,詳見圖8。槲皮素通過作用于靶點TNF、IL6、TP53、JUN、VEGFA調(diào)控TNF信號通路、癌癥通路、PI3K-Akt信號通路等,說明四妙勇安湯是通過多靶點、多通路共同作用治療冠心病。

圖7 KEGG富集分析

圖8 關(guān)鍵活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接技術(shù) 根據(jù)“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,得到關(guān)鍵活性成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素、刺芒柄花素、異鼠李素。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示,TNF、IL6、TP53、JUN、VEGFA可能是四妙勇安湯治療冠心病的關(guān)鍵靶點。分子對接結(jié)果表明：四妙勇安湯的8個關(guān)鍵成分與5個關(guān)鍵蛋白質(zhì)的結(jié)合能均≤-20.93 kJ/mol, 說明各成分及各蛋白的結(jié)合能力均較好,詳見表3。將對接結(jié)果導入PyMOL軟件使其可視化,部分結(jié)果見圖9。

表3 分子對接結(jié)合能 單位：kJ/mol

圖9 四妙勇安湯部分活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

3 討 論

中醫(yī)學無“冠心病”病名,將其歸屬于“胸痹”“心痛”范圍。中醫(yī)學認為冠心病病機屬本虛標實,本虛為臟腑虧虛,以心氣虛最主要,也可見心陰虛,氣虛進一步發(fā)展為陽虛,標實主要是指瘀血內(nèi)阻[10]。陳可冀院士提出的“瘀毒致病”理論,認為冠心病病人病機關(guān)鍵在于血瘀,血瘀貫穿于整個病理過程,瘀血蘊結(jié)不解,日久可化熱生毒,或從化為毒,長久不愈,一旦遇外因觸動,瘀毒驟發(fā),蝕肌傷肉,瘀毒搏結(jié),可發(fā)生急性心血管事件[11]。有研究表明,兼具活血解毒功效的藥物抗炎、穩(wěn)定斑塊作用較單純活血或解毒的藥物較好[12]。四妙勇安湯可清熱解毒、活血止痛,全方含有金銀花、玄參、當歸、甘草4種藥物,金銀花甘寒,清熱解毒,重用為君;玄參清熱涼血、滋陰解毒,合君藥清熱解毒之力更強;當歸辛甘溫,補血化瘀,合玄參養(yǎng)血生新;甘草解毒和中,用為佐使,臨床廣泛用于冠心病的治療,但作用機制尚未明確。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討四妙勇安湯治療冠心病的作用機制,結(jié)果表明,四妙勇安湯的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等,其中槲皮素和山柰酚存在于金銀花、甘草中。 Chekalina等[13]將冠心病病人分為對照組和研究組,對照組口服β受體阻滯劑、他汀類藥物、阿司匹林治療,研究組在對照組基礎(chǔ)上加用槲皮素每日120 mg治療,24 h動態(tài)心電圖結(jié)果顯示,槲皮素組ST段壓低總時間和發(fā)作次數(shù)減少,室性期前收縮數(shù)量減少。 張福宸等[14]研究表明,槲皮素可增強慢性心力衰竭大鼠心功能,其機制可能是下調(diào)TNF-α介導的抑制炎癥反應(yīng)。槲皮素能改善過氧化氫(H2O2)介導的心肌細胞氧化損傷,減少心肌細胞凋亡,通過抗氧化、抗炎作用,保護心血管的結(jié)構(gòu)及功能[15]。 山柰酚的抗炎作用已被證實,可抑制促炎因子產(chǎn)生及mRNA表達,如TNF-α、白細胞介素8(IL-8)等,調(diào)節(jié)單核細胞到巨噬細胞的分化、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及巨噬細胞的活化,具有較強的抗炎作用[16]。湯喜蘭等[17]研究顯示,槲皮素和山柰酚有明顯的抗心肌細胞缺氧復氧損傷作用,是心肌缺血再灌注損傷的治療基礎(chǔ)。

根據(jù)藥物-疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖,四妙勇安湯治療冠心病的核心靶點主要包括TNF、IL6、TP53、JUN、VEGFA、表皮生長因子受體(EGFR)等,通過靶點相互作用,抗炎穩(wěn)定斑塊。炎性因子可影響動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性,在預測冠心病危險中有重要的參考意義[18]。 TNF-α是由活化的巨噬細胞分泌,是作用廣泛的促炎細胞因子,存在于動脈硬化損傷部位,介導多種作用,引起炎癥進展、斑塊不穩(wěn)定性增強及血栓形成[19]。 有研究表明,TNF-α可縮短編碼一氧化氮合酶mRNA的半衰期,一氧化氮(NO)可減少血小板聚集、單核細胞黏附、平滑肌細胞增殖,從而影響斑塊穩(wěn)定性[20]。IL6是促炎細胞因子,是判斷動脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定的重要標志物。有研究顯示,IL6是一種上游炎癥標志物,與穩(wěn)定型冠心病病人主要不良心血管事件、心血管疾病和全因死亡率、心肌梗死和癌癥死亡率獨立相關(guān)[21]。 IL6是由活化的免疫細胞產(chǎn)生,促進凝血且誘導產(chǎn)生超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP),引發(fā)急性炎癥反應(yīng),導致斑塊形成,影響斑塊穩(wěn)定性[22],且IL6能刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)升高,分解細胞基質(zhì)核心物質(zhì)膠原纖維,纖維帽變薄,動脈斑塊不穩(wěn)定性增加[23]。 因此,IL6增多可影響斑塊的穩(wěn)定。有研究顯示,TP53蛋白是轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控細胞生長及誘發(fā)凋亡,正常狀態(tài)下,TP53不斷降解維持較低水平,細胞損傷時,中斷了TP53蛋白的降解,蛋白水平上升以激活并啟動對細胞的修復作用,但細胞損傷嚴重不能完全恢復時,引起細胞凋亡[24],血管平滑肌細胞異常增殖和凋亡與動脈粥樣硬化關(guān)系密切。李敏華[25]指出TP53可能通過干預動脈粥樣斑塊形成,參與冠心病的進程。 房間隔缺損是冠心病的常見亞型,Wang等[26]研究分析發(fā)現(xiàn),房間隔缺損的隔膜組織中VEGFA下調(diào),說明其可能影響心房間隔形成、心肌細胞增殖和心肌發(fā)育。有研究顯示,VEGF水平與頸動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)有關(guān),推測VEGF的產(chǎn)生可能加速動脈粥樣硬化的發(fā)展[27]。 以上靶蛋白相互作用,可能是四妙勇安湯治療冠心病的關(guān)鍵機制。

GO生物過程涉及對缺氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)、細胞外空間、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、對藥物的反應(yīng)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號通路、線粒體、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,四妙勇安湯治療冠心病的靶點主要集中在TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、鈣信號通路等。PI3K-Akt信號通路是人體內(nèi)重要的調(diào)控血管再生、心肌細胞凋亡及代謝的通路[28]。有研究表明,心力衰竭大鼠心臟組織miR-146a表達顯著上調(diào),可能通過啟動PI3K/Akt信號通路發(fā)揮miR-146a促使心肌細胞凋亡的作用[29]。李賽賽等[28]研究顯示,PI3K/Akt信號通路參與抑制心肌細胞凋亡,減輕炎癥反應(yīng),改善心臟代謝,可作為防治心血管疾病的切入點。吳勝男等[30]研究顯示,PI3K/Akt信號通路可能在內(nèi)嗎啡肽-1處理后出現(xiàn)的減輕心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮介導作用。HIF-1信號通路是復方治療心肌缺血的特征通路,缺氧時HIF-1α過表達導致細胞代謝紊亂,破壞心肌細胞,中藥活性成分可抑制糖氧剝奪心肌細胞中HIF-1α蛋白的過表達以抑制HIF-1信號通路,從而保護心肌[31]。 Ca2+處理和信號蛋白在維持心臟功能中作用重要[32]。說明四妙勇安湯通過多通路-多途徑參與治療冠心病。

由分子對接結(jié)果可知,四妙勇安湯的關(guān)鍵活性成分和核心蛋白質(zhì)的結(jié)合能均≤-20.93 kJ/mol ,說明四妙勇安湯中的活性化合物與核心蛋白結(jié)合能力較強,結(jié)合較穩(wěn)定,驗證了本研究的預測結(jié)果。

綜上所述,四妙勇安湯中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分通過TNF、IL6、TP53、VEGFA等靶點對TNF、PI3K-Akt、HIF-1等信號通路進行調(diào)控以影響機體對缺氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)、細胞外空間等過程治療冠心病。因此,今后的研究應(yīng)在此基礎(chǔ)上進行動物實驗驗證,進而深入討論四妙勇安湯治療冠心病的基礎(chǔ)作用機制。